Анализ Трисахариды молока Fucosylated человека в биотехнологических контексте с использованием генетически закодированный биосенсоров
Summary
Мы опишем здесь высок объём обнаружения и количественного определения fucosylated олигосахаридов грудного молока (ОУМ) с помощью биосенсора поклеточного. Мы также демонстрируют здесь, адаптация этой платформы к анализу HMO производства штаммов, уделяя особое внимание улучшению соотношение сигнал-шум.
Abstract
Олигосахаридов грудного молока (ОУМ) являются компонентами сложный углевод человеческого грудного молока, которые демонстрируют обильные преимущества детского здоровья. Однако оптимизации их биотехнологического синтеза ограничивается относительно низкую пропускную способность обнаружения и количественного определения моносахаридов и связей. Обычные методы анализа glycan включают хроматографии/масс спектрометрического методов с пропускной способностью порядка сотни образцов в день без автоматизации. Мы показываем здесь, генетически закодированный бактериальных биосенсора для высокой пропускной способности, связь конкретных обнаружения и количественного определения структур fucosylated HMO, 2′-fucosyllactose и 3-fucosyllactose, которого мы достигли через гетерологичных выражение fucosidases. Как присутствие лактозы в молоке или в биотехнологических процессов может привести к ложным положительным результатам, мы также демонстрируют сокращение сигнала от лактозы, используя различные стратегии. Благодаря высокой пропускной способности этой техники много условий реакции или биореактор параметров может assayed параллельно в течение нескольких часов, что обеспечивает возможность оптимизации производства HMO.
Introduction
Олигосахаридов грудного молока (ОУМ) являются лактоза производные олигосахариды, обычно состоит из трех до восьми сахара мономеров. Они имеют лактозы (Гал β1, 4-Glc) уменьшение конец и далее вытянутые гликозидные связи (β-1,3 – или β-1,6-) глюкозы (КЗС), галактозу (Gal) или N-acetylglucosamine (GlcNAc). Кроме того Фукоза (ОФП, α-1,2 – или α-1,3-) или сиаловая кислота (Sia или NeuAc, α-2,3 – или α-2,6-) остатки часто добавляется1.
Текущий анализ олигосахаридов и других углеводов в пропускную способность и объем ограничен потребность хроматографии/масс-спектрометрии (МС) технология2,3,4,5, 6 , 7, который может занять примерно час образец, не говоря уже о необходимости дорогостоящего оборудования, специализированных столбцов и derivatizing агентов и специалистов по эксплуатации этого оборудования8. Олигосахариды связей особенно трудно определить, требующих передовых MS9,10 или методы ядерного магнитного резонанса (ЯМР)11. Быстрая оптимизация синтеза этих олигосахариды ограничивается таким образом пропускная способность этой медленной аналитической шаг.
В этом исследовании, мы продемонстрировать связь конкретного выявления fucosylated Трисахариды лактозы основе поликлиниками, сосредоточив внимание на 2′-fucosyllactose (2′-FL), является наиболее распространенным HMO в человеческом молоке, с использованием генетически закодированный Escherichia coli клеточных Биосенсор с пределом обнаружения на 4 мг/л. Важной особенностью этой биодатчик является его способность различать изомерных Трисахариды. Принцип конструкции на основе выражения конкретных fucosidases в E. coli , освободить лактозы с поликлиниками, присутствие которых обнаруживается lac -оперона, который в свою очередь генерирует сигнал флуоресцентные. Мы добиться этого путем создания системы двух плазмиды, один укрывательство связь конкретных fucosidase и другой белок флуоресцентные репортер. Этот биодатчик платформа подходит для высокопроизводительного скрининга проточной цитометрии или микро плита читателя. Мы также демонстрируют использование биосенсор в количественном определении 2′-FL, производимые инженерии штамм12. В рамках этого исследования мы также представляем три стратегии на селективного удаления лактозы, что может привести к ложным положительный сигнал от биосенсор, учитывая, что штамм инженерии продюсер выращивается на лактозу.
Вместе взятые, генетически закодированный биодатчики позволяют нам выявлять и количественно HMOs связь конкретным образом, что трудно даже с хроматографического, MS, или ЯМР методами. Благодаря своей высокой пропускной способности и простоты использования этот метод должен иметь широкое применение в метаболический инжиниринг и синтез HMOs.
Protocol
Representative Results
Discussion
Мы представляем высок объём стратегию для выявления конкретных связей fucosylated олигосахаридов грудного молока. Это было достигнуто путем построения клеточных биодатчики, генетически инженерных E. coli , который после индукции с конкретными гликанов реагировать с флуоресцентного сиг?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана средств запуска Айова государственного университета. Отвязка частично финансировалась NSF Trinect стипендий и Мэнли Hoppe профессора. T.J.M. был частично поддерживается Карен и Денни вон факультета стипендий. Авторы благодарят Айова государственного университета потока цитометрии фонда и W.M. Keck метаболомики научно-исследовательская лаборатория для помощи с флуоресценции и LC-MS исследования.
Materials
| 2’-Fucosyllactose | Carbosynth | 41263-94-9 | |
| 3-Fucosyllactose | Carbosynth | 41312-47-4 | |
| Agar | Fisher Scientific | BP9744500 | |
| Calcium Chloride, Dihydrate | Fisher Scientific | C79-500 | |
| Carbenicillin | Fisher Scientific | BP26481 | |
| Dextrose (D-Glucose), Anhydrous | Fisher Scientific | D16-1 | |
| Flow Cytometer | BD | FACSCanto Plus RUO | |
| HPLC | Agilent Technologies | 1100 Series HPLC system | |
| HPLC Column | Luna | C18 reversed phase column | |
| Kanamycin | Fisher Scientific | 11815024 | |
| LB Broth, Miller | Fisher Scientific | 12-795-027 | |
| Lactose | Fisher Scientific | 64044-51-5 | |
| M9, Minimimal Salts, 5x | Sigma-Aldrich | M6030 | |
| Magnesium Sulfate, Anhydrous | Fisher Scientific | M65-500 | |
| MS | Agilent Technologies | Mass Selective Trap SL detector | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | 7647-14-5 | |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | 7558-79-4 | |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | 13472-35-0 |
References
- Ninonuevo, M. R., et al. A strategy for annotating the human milk glycome. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 54 (20), 7471-7480 (2006).
- Kailemia, M. J., Ruhaak, L. R., Lebrilla, C. B., Amster, I. J. Oligosaccharide analysis by mass spectrometry: a review of recent developments. Analytical Chemistry. 86 (1), 196-212 (2014).
- Royle, L. Chapter 8 – Glycans and Monosaccharides. Liquid Chromatography. , 185-202 (2013).
- Shubhakar, A., Reiding, K. R., Gardner, R. A., Spencer, D. I. R., Fernandes, D. L., Wuhrer, M. High-Throughput Analysis and Automation for Glycomics Studies. Chromatographia. 78 (5-6), 321-333 (2015).
- Goubet, F., Jackson, P., Deery, M. J., Dupree, P. Polysaccharide analysis using carbohydrate gel electrophoresis: a method to study plant cell wall polysaccharides and polysaccharide hydrolases. Analytical Biochemistry. 300 (1), 53-68 (2002).
- Evangelista, R. A., Liu, M. -. S., Chen, F. -. T. A. Characterization of 9-Aminopyrene-1,4,6-trisulfonate Derivatized Sugars by Capillary Electrophoresis with Laser-Induced Fluorescence Detection. Analytical Chemistry. 67 (13), 2239-2245 (1995).
- Jiao, J., Zhang, H., Reinhold, V. N. High Performance IT-MS Sequencing of Glycans (Spatial Resolution of Ovalbumin Isomers). International Journal of Mass Spectrometry. 303 (2-3), 109-117 (2011).
- Doherty, M., et al. An automated robotic platform for rapid profiling oligosaccharide analysis of monoclonal antibodies directly from cell culture. Analytical Biochemistry. 442 (1), 10-18 (2013).
- Hsu, H. C., Liew, C. Y., Huang, S. -. P., Tsai, S. -. T., Ni, C. -. K. Simple Method for De Novo Structural Determination of Underivatised Glucose Oligosaccharides. Scientific Reports. 8 (1), 5562 (2018).
- Mank, M., Welsch, P., Heck, A. J. R., Stahl, B. Label-free targeted LC-ESI-MS2 analysis of human milk oligosaccharides (HMOs) and related human milk groups with enhanced structural selectivity. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 411 (1), 231-250 (2019).
- Chai, W., Piskarev, V. E., Zhang, Y., Lawson, A. M., Kogelberg, H. Structural determination of novel lacto-N-decaose and its monofucosylated analogue from human milk by electrospray tandem mass spectrometry and 1H NMR spectroscopy. Archives of Biochemistry and Biophysics. 434 (1), 116-127 (2005).
- Baumgärtner, F., Seitz, L., Sprenger, G. A., Albermann, C. Construction of Escherichia coli strains with chromosomally integrated expression cassettes for the synthesis of 2’-fucosyllactose. Microbial Cell Factories. 12 (1), 1-13 (2013).
- Matsuki, T., et al. A key genetic factor for fucosyllactose utilization affects infant gut microbiota development. Nature Communications. 7, 11939 (2016).
- Enam, F., Mansell, T. J. Linkage-Specific Detection and Metabolism of Human Milk Oligosaccharides in Escherichia coli. Cell Chemical Biology. 25 (10), 1292-1303 (2018).
