이 방법에서는, 배아 심장 조직 microdissected, 해리, 붙일 레이블 및 호스트 배아 조직으로 이식 수술이 있습니다. 이 개인 또는 조직 수준 발달 조직 아래 소성 hemodynamic 조건 및/또는 변경된 paracrine/juxtacrine 환경 공부를 위한 플랫폼을 제공 합니다.
세포 계보 결심에 외부 microenvironmental 영향 대 셀 자치 패턴의 상대적 영향 해석 발달 생물학 연구에서 일반적인 문제를 나타냅니다. 배아 심장에서이 특히 transcriptional 레 귤 레이 터, paracrine/juxtacrine 신호 신호의 표현에 있는 지역 다름으로 어려울 수 있습니다 그리고 hemodynamic 힘 모두 cardiomyocyte 성숙에 영향을 알려져 있습니다. 따라서, 개발 cardiomyocyte 분자와 biomechanical microenvironment를 변경 하는 단순화 된 방법, 어떻게 지역 조건 영향 세포 운명 및 기능을 검사 하는 강력한 기술 역할을 합니다. 이 해결 하기 위해 우리는 물리적으로 청소년 cardiomyocytes 심장이 나 주변 배아 조직에서 소성 위치에 이식 하는 방법을 최적화 했습니다. 이 단일 셀 해상도 그대로 태아 내에서 어떻게 microenvironmental 조건 영향 cardiomyocyte 운명 전환 검사 수 있습니다. 여기, 우리는 배아 myocytes 심장 하위 도메인의 다양 한 절연, 해리, 붙일 레이블이 고 수 높은 정밀도 함께 호스트 배아로 microinjected 프로토콜을 설명 합니다. 셀 수 다음 직접 분석 원래의 장소에 다양 한 이미징 및 조직학 기법을 사용 하 여. 이 프로토콜은 심장 등 움직이는 조직에 prohibitively 어려울 수 있는 전통적인 이식 실험에 대 한 강력한 대안입니다. 이 방법의 일반적인 개요는 다양 한 기증자 조직 및 호스트 환경, 그리고 저렴 한 비용, 사용의 용이성에도 적용할 수 있습니다 그리고 속도 발달 연구의 다양 한 잠재적으로 유용한 응용 프로그램.
심장 발달 연구는 유전자 규제 네트워크의 많은 그 패턴 다른 세포 계보와 기능 도메인에에서 식별 생식 유전자 변형 모델 시스템의 출현에서 거 대 하 게 유익 했다. 그러나, 식별이 유전자 네트워크와 상호 작용 및 microenvironmental 조건에 응답 하는 방법 paracrine/juxtacrine 신호 및 생물 입력 (스트레칭, 스트레인, hemodynamic 흐름)를 포함 하 여 전하실 수 있습니다. 이와 같이, 그것은 항상 쉽지 않다 세포 표현 형 발생 변화 심장 역학 또는 더 높은 순서 조직 구성1,2에 유전 섭 동에의 직접적인 결과 또는 adaption의 보조 결과 여부를 결정 하 .
접목 운명 사양의 주소 개념에 사용 된 고전적인, 실험, 유도, 헌신과 능력3,4, 나타내는 것 이라고에 내재 된 문제 중 일부를 우회 하는 이상적인 접근 에 셀 환경 영향 대 자치를 정의합니다. 불행 하 게도, 심장 수축 어려워질 표준 접목 방법. 조직의 급속 한 운동을 자주 마음에 준수에서 이식할된 세포를 방지 하 고 큰 조직의 구멍 (일반적으로 접목에 필요한) 자주 심장 마비와 배아 치 사 율5,,67이어질. 따라서, 압력 기반 개발 했습니다, 그리고 microinjection 시스템의 조직 접목 기술 장애물을 우회 개발 여자 마음에 정밀 세포 이식에 대 한 기술 이전8,9. 이 기술을 사용 하 여, 수 개인 또는 소규모 그룹 기증자의 배아에서 분리 된 심장 세포의 광범위 한 호스트 준비 및 사용 하 여 발생 하는 큰 조직 모욕에 대 한 필요성을 제거 하는 호스트 배아 마음의 영역의 다양 한으로 microinjected 수 합니다. 표준 이식 기법입니다. 이러한 이식 연구에 사용 되는 microinjection 바늘의 외부 직경을가지고 ~ 바늘 대상 조직에 직접 배치할 수 있습니다 즉 30−40 µ m (즉, 배아 심근 벽을 관통할 수 있다) 그리고 셀 전달할 수 있습니다 focally 주변 조직에 최소한의 손상입니다. 동위 원소, heterotopic, isochoric, 그리고 heterochronic 조작, 유연한, 빠르고 저렴 한 비용 접근 방식을 직접 검사 개발에 고아 한 실험적인 embryological 패러다임 제공의 다양 한 수행 하는 프로토콜을 사용할 수 있습니다. 4 연 발 심장입니다.
아래에 설명 된 프로토콜에서 우리 기증자 셀 permeant 형광 염료, microinjection 실험의 성공에 대 한 실시간으로 모니터링할 수 있는 셀을 라벨에 대 한 필요 없이 문서화 engrafted 셀의 위치 추가 얼룩. 그러나,이 접근은 단기 실험 (약 48 h)에 형광 성 염료는 세포 분열을 통해 손실 될 수 있습니다 주목 해야한다. 대체 방법은 더 긴 기간 실험을 위해 사용할 수 있습니다.
우리는 심장 개발의 맥락에서이 기법을 제시 하 고, 하는 동안 우리는 사용 그것은 큰 효과를 세포 이식 실험 mesoderm, 머리, 팔 다리, 그리고 somites에. 따라서 아래 설명 된 기본적인 접근 매우 온순한 이며 기관 시스템의 다양 한에서 사용할 수 있습니다.
영향의 방법을 microenvironmental 조건 심장 세포 운명 명세와 혈통 안정화를 정의 하는 선 천 성 심장 질환도 적절 한에 대 한 효율적인 프로토콜을 개발로 압축 이해를 만드는 기본 줄기 세포 나 체세포 reprograming 기반 cardiomyocytes 성숙 프로토콜 설명 제공 위에 조사 능력에서 심장 세포 개발을 직접 시험을 vivo에서 조건, 셀 자치 성숙 프로세스 또는 hemodynamic paracrine/juxtacrine 신호에서 분리 될 수 있도록 변경. 고해상도 영상, 유전자 분석, 그리고 생리 적인 분석 실험 결합,이 기술은 기존의 유전자 변형 모델에 강력한 보완 될 수 있습니다.
기술 서 지점 양식, 효율적인 절연, 라벨, 및 호스트 배아 조직에 기증자 심 혼 세포의 정확한 주입에 여기에 제시 된 프로토콜 의존 합니다. Microinjection 시스템의 사용 크게 에이즈 기증자 세포를 대상으로 하 고 호스트 조직에 큰 engraftment 사이트를 만들기 위한 필요 없이 성공적인 이식에 대 한 있습니다. 그러나,이 방법을 수행 하려면 일부 운영 기술 필요 감소 된 생존 능력 주사 바늘 (심장 또는 로컬 맥 관 구조의 파열을 일으키는) 대상 조직에 신중 하 게 배치 되지 않습니다 경우 발생할 수 있습니다. 관심과 생각 또한 격리와 라벨 단계에 부여 되어야 합니다. 기증자의 소화 동안 조직 가난한 주입 효율, 이어질 수 있습니다 그리고 과도 기술 라벨 시간대는 기증자 세포 추적할 수 있습니다 (세포 분열 라벨 희석 수)로 제한할 수 있습니다.
이 기술은 매우 대 이며 다양 한 목적에 적응 시킬 수 있다. 예를 들어 기증자 세포 조직 및 단계의 넓은 범위에서 (비록 효소 소화의 최적화가 필요) 격리 될 수 있으며 마찬가지로 수 개발의 여러 단계에 걸쳐 다양 한 호스트 조직에 주입. 마찬가지로, 레이블 접근 이상 과도 라벨에 대 한 형광 무기 반도체 나노를 사용 하 여, 메 셀 이나 녹색에서 세포의 이식 등 다른 시간 창에서 셀을 추적을 수정할 수 있습니다. 형광 단백질 유전자 변형 (GFP +) 기증자 배아11 permeant 라벨에 대 한.
우리는 현재이 기법을 사용 하 여 조류 이식 연구에 대 한, 우리는 사용 될 수 공상 연구의 넓은 범위에 대 한 미래에 느낀다. 예를 들어 유전자 변형 유기 체에서 유전으로 변경 된 심장 세포 격리 수 있고 매우 유사한 프로토콜을 사용 하 여 새 마음으로 microinjected. 또한, 세포에서 cardiomyocytes에 분화 줄기 세포 또는 체세포 reprograming 접근을 통해 배아 심장 조직 또는 biomechanical vivo에서에서 성숙에 그들의 통합을 평가에 microinjected 수 있습니다. 조건입니다.
The authors have nothing to disclose.
이 작품은 건강의 국가 학회, 국가 심 혼, 폐, 혈액 연구소 (NHLBI)에서 그랜트 R00HL122360에 의해 지원 되었다.
1 mL Insulin Syringe | BD | 329654 | |
1.7 mL Microtubes, Clear | Genesee Scientific | 24-282 | |
10 ml Syringe | BD | 305482 | |
1000ul Reach Barrier Tip Racked, Sterile | Genesee Scientific | 24-430 | |
15 mL Centriguge Tubes, Racked | Genesee Scientific | 28-101 | |
1588 Genesis Hova-Bator Incubator | GQF | 813927021221 | |
18G x 1 1/2 Needle | BD | 305196 | |
200ul Barrier Tip Low Binding, Racked, Sterile | Genesee Scientific | 24-412 | |
32G x 1/2" Needle | TSK Steriject Air-Tite | TSK3213 | |
Alchohol Wipes 70% | Thermo Fisher Scientific | 19015744 | |
Angled Forceps | Fine Scientific Tools | 11260-20 | |
Backloading Tips | Eppendorf | 930001007 | |
Black India Ink | KOH-I-NOOR | 3084-F | |
CellTracker Green CMF | Thermo Fisher Scientific | C7025 | 1 mM in DMSO |
CellTracker Red CMTPX | Thermo Fisher Scientific | C34552 | 1 mM in DMSO |
Centrifuge | Eppendorf | 5424R | |
Commercial Grade Packing Tape | Staples | 2619001 | |
Curved Tenotomy Scissors | Fine Scientific Tools | 14067-11 | |
DMEM/F12 | Thermo Fisher Scientific | 11330-032 | |
DMSO, anhydrous | Thermo Fisher Scientific | D12345 | |
DPBS (10X), no calcium, no magnesium | Thermo Fisher Scientific | 14025092 | |
Femtojet 4i | Eppendorf | 5252000021 | |
Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 10437-028 | |
Hatching Eggs | Pilgrim's Hatchery | — | |
HBSS, calcium, magnesium, no phenol red | Thermo Fisher Scientific | 14025-092 | |
Injectman 4 | Eppendorf | 5192000027D | |
Micromanipulator | Leica Microsystems | — | |
Parafilm | SIGMA | P6543-1EA | |
Paraformaldehyde 32% in aqueous solution, EM Grade | VWR | 100496-496 | |
Penicillin/Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140-022 | |
Petri Dish | Genesee Scientific | 32-107 | |
Pipette Grinder | Narishige | EG-44 | |
Pipette Puller | HEKA | PIP 6 | |
Scotch Transparent Tape | Staples | 487909 | |
Sigmacote | SIGMA | SL2-25ML | |
Stereo Microscope | Leica | — | |
ThermoMixer C | Eppendorf | 5382000023 | |
Thin Wall Glass Capillaries | World Precision Instruments | TW100F-4 | |
Transfer Pipette | Thermo Fisher Scientific | 273 | |
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25300-054 |