نموذج الإدارة عن طريق الفم Galleria mellonella للاستجابات المناعية الفطرية Study Commensal-Induced
Summary
هنا، نحن نقدم بروتوكول مفصل لنموذج إدارة عن طريق الفم استخدام اليرقات Galleria mellonella وكيفية توصيف فعل الاستجابات المناعية الفطرية. باستخدام هذا البروتوكول، سوف تكون قادرة على استخدام ميلونيلا G. التسمين أسلوب الباحثين دون خبرة عملية.
Abstract
التحقيق في احتمال مكسبه للبكتيريا commensal على المضيف المناعي هو واحد من المكونات الأساسية عند دراسة التفاعلات بين الميكروبات المعوية والمضيف. ومن الثابت أن كومينسالس مختلف يحمل إمكانات مختلفة تنشيط الجهاز المناعي المعوي المضيف. هذه التحقيقات تشمل الحيوانات الفقارية، لا سيما من القوارض. نظراً لتزايد مخاوف أخلاقية ترتبط بالتجارب التي تنطوي على الفقريات، هناك ارتفاع طلب على نماذج الاستبدال اللافقارية.
هنا، نحن نقدم نموذج إدارة عن طريق الفم Galleria mellonella استخدام البكتيريا غير ممرضة commensal وتقييم إمكانات مكسبه commensals ممكن على نظام المناعة ميلونيلا G. . ونحن تبين أن ميلونيلا G. نموذج استبدال اللافقارية بديلة مفيدة تتيح تحليل commensals مع إمكانات مكسبه مختلفة مثل الأنواع فولجاتوس والاشريكيه القولونية. من المثير للاهتمام، عرضت البكتيريا أي أثر مقتل على اليرقات، ومماثلة للثدييات. الاستجابات المناعية ل G. mellonella قابلة للمقارنة مع الاستجابات المناعية الفطرية الفقاريات وتشمل الاعتراف بالبكتيريا وإنتاج الجزيئات المضادة للميكروبات. ونحن نقترح أن G. ميلونيلا كان قادراً على استعادة التوازن الحجمية السابقة، ومعروف جيدا من الأصحاء الثدييات. على الرغم من أن توفير الاستجابات المناعية الفطرية قابلة للمقارنة في ميلونيلا G. والفقريات، عدم إيواء G. ميلونيلا الجهاز المناعي التكيفي. منذ التحقيق مكونات نظام المناعة الفطرية تطورية المصانة، النموذج يسمح بتحليل الغربلة والأولى لخصائص مكسبه البكتيرية.
Introduction
ميكروبيومي المعوية هو عنصر أساسي للحفاظ على التوازن، ويشمل كلا من الاستجابات المناعية الفطرية والتكيف21،. يتسم المجتمع الحجمية commensal بمختلف مكونات commensal الرئيسي: سيمبيونتس التي تمنح الآثار المفيدة بوظائف هامة إيمونومودولاتوري، باثوبيونتس التي يمكن أن تكون لها آثار ضارة استعداد وراثيا يستضيف والترويج وتؤدي إلى التهاب الأمعاء3،4. قد تم نشر العديد من الدراسات على سيمبيونتس وباثوبيونتس وتأثيرها على النظام المناعي المضيف أساسا دراسة الاستجابات المناعية التكيفية.
أن هذه الدراسات تشمل العديد من الحيوانات للتحقيقات، والحماية، واستبدال الحيوانات المستخدمة للتجريب زيادة اهتمام الجمهور، ونحن نسعى إلى إيجاد نموذج بديل للسماح لفحص البكتيريا المختلفة مكسبه خصائص. الحشرات، لا سيما Galleria mellonella، نموذج استبدال مستخدمة على نطاق واسع في البحوث العدوى. زاي-ميلونيلا يجمع بين مزايا مختلفة مثل تكاليف منخفضة وعالية الإنتاجية؛ أنه يسمح للفم من البكتيريا، وهو مسار التعرض الطبيعي، وأنه يسمح للعدوى المجموعية5،6. ميلونيلا G. كذلك تمكن الحضانة عند 37 درجة مئوية، وهي درجة حرارة الجسم الفسيولوجية للثدييات والأمثل ل التعبير عامل الفوعة الجرثومية5. والميزة الرئيسية ل G. mellonella هو نظام المناعة الفطرية المصانة تمكن التمييز الذاتي من غير المتمتعة بالحكم الذاتي وترميز مجموعة متنوعة من نمط الاعتراف المستقبلات مثل أبوليبوفورين أو طاهية هيمولين6، 7-عند الاعتراف بميكروب، يمكن أن تؤدي ميلونيلا G. مختلف الاستجابات المناعية خلطيه المتلقين للمعلومات. ويمكن حمل ردود الأكسدة وتفرز أنواع الأكسجين التفاعلية (روس) الذي ينطوي على نشاط NOS (أوكسيديز النيتريك synthase) وأكاسيد النيتروجين (نادف أوكسيديز)6،8. وباﻹضافة إلى ذلك، ينشط ميلونيلا G. استجابة قوية ببتيد مضادات الميكروبات (أمبير)، مما يؤدي إلى إفراز خليط أمبير مختلفة مثل جلوفيرين ومرسين، سيكروبين أو جاليريميسين مثل ديفينسين6، 89،،10. وبصفة عامة، الامبير خصوصية المضيف واسع النطاق ضد الجراثيم إيجابية وسلبية الغرام والفطريات ويكون لتوفير استجابة فعالة نظراً للحشرات ولا توجد أي استجابة تكيفية10. جلوفيرين أمبير نشط ضد البكتيريا والفطريات ويحول دون تشكيل الغشاء الخارجي6،11. معرض موريسنس وظيفتها الميكروبات ضد الجراثيم إيجابية وسلبية الغرام باختراق الغشاء وتشكيل9،مسام11. سيكروبينس تقديم نشاط ضد البكتيريا والفطريات والغشاء وبالمثل مثل موريسينس9،10بيرميبيليزي. جاليريميسين ببتيد مثل ديفينسين مع الخصائص المضادة للفطريات9. من المثير للاهتمام، أنه وجد أن الجمع بين سيكروبين وجاليريميسين بنشاط تعاوني ضد كولاي10.
بسبب طابعها سهلة الاستخدام ميلونيلا G. يرقات نموذج عدوى غالباً ما تستخدم لتقييم القدرة الإمراضية البكتيرية. على وجه الخصوص، دراسات في البيانات التي تم الحصول عليها من ميلونيلا G. ترتبط بالبيانات المتحصل عليها من الفئران دعم قوة هذا النموذج مضيفة بديلة. ووجد أن اللقاح المسببة للمرض أكثر من الليستريه المستوحدة في نموذج عدوى ماوس يؤدي أيضا إلى ارتفاع معدلات الوفيات في ميلونيلا G. بعد الإصابة الجهازية. علاوة على ذلك، أقل ضراوة اللقاح تبين أنها أيضا أقل ضراوة في نموذج ميلونيلا زاي- 12. ملاحظات مماثلة بذلت مع الفطريات المسببة للأمراض البشرية المبيضات البيض. فوعة مختلفة المبيضة وقسمت سلالات العدوى المجموعية والمراقبة اللاحقة لبقاء اليرقات. كانت سلالات avirulent الماوس أيضا أفيرولينت أو المشاركة انخفاض ضراوة في G. ميلونيلا، بينما سلالات ضراوة الماوس يؤدي أيضا إلى ارتفاع معدل وفيات اليرقات13. الطراز ميلونيلا G. يمكن استخدامها كذلك تحديد نوع 3 إفراز منظومة العوامل الإمراضية الزائفة الزّنجاريّة14.
حيث تركزت معظم التحقيقات التي تشمل ميلونيلا G. على عوامل الفوعة استخدام النهج العدوى المجموعية كنا مهتمة بصفة خاصة في توفير وسيلة مناسبة لتحليل كومينسالس المعوية في التسمين الفم النموذج الذي نحن تطبيق جرعة مميزة من البكتيريا الواحدة واليرقات ولكن ليس فقط مراقبة معدل الوفيات اليرقات تحليل بصمات مختلفة من الاستجابات المناعية الفطرية للحفاظ على التوازن المعوية.
لدينا أسلوب يساعد على زيادة استخدام mellonella زاي- كنموذج بديل منذ أن نجمع بين تطبيق البكتيريا وتحليل الحمض النووي الريبي التعبير. أنها ليست فقط مفيدة لتعزيز معنى الدراسات المرضية البكتيرية عندما بما في ذلك تحليل الاستجابات المناعية بعد الإدارة عن طريق الفم، وليس فقط مراقبة معدلات الوفيات بعد الإصابة الجهازية. أساليب عملنا ويسمح لتحليل خصائص مكسبه للبكتريا غير ممرضة commensals نظراً لأنها توفر ظروف أكثر تعقيداً من خلية ثقافة بتوفير حاجز الأمعاء في حي.
Protocol
Representative Results
Discussion
يعتبر هذا النموذج ميلونيلا G. نموذج المستخدمة بشكل متكرر لتقييم عوامل الفوعة الجرثومية في نهج عدوى المجموعية21. نظراً للعديد من العوامل الممرضة والبكتيريا أدخل المضيف عبر طريق الاستعمار أو العدوى عن طريق الفم، تحتاج إلى رؤى جديدة الاطلاع على تقييم ميلونيلا زاي- كنمو…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم تمويل هذا العمل DFG (SPP1656) ومجموعة التدريب البحوث DFG 1708، أوند فيما für بونديسمينيستيريوم Forschung (الألمانية)، والمركز الألماني لبحوث الإصابة (دزيف).
Materials
| 1.5 mL tubes | Eppendorf | 0030120086 | |
| 100 bp DNA ladder | Thermo Fisher Scientific | 15628019 | |
| 1-Bromo-3-Chloropropane (BCP) | Sigma-Aldrich | B9673 | |
| 2 mL tubes | Eppendorf | 0030120094 | |
| 2x Mangomix | Bioline | BIO-25033 | Colony PCR |
| 50 mL tubes | Greiner Bio-One | 210 261 | |
| Agarose | Biozym | 840004 | |
| Beeswax | Mixed-Store.de | - | |
| Brain heart infusion broth | Thermo Fisher Scientific | CM1135 | |
| CloneJET PCR Cloning Kit | Thermo Fisher Scientific | K1232 | Cloning vector for 16S fragments |
| Corn grits | Ostermühle Naturkost GmbH | 306 | Organic cultivation |
| Difco LB Agar, Miller (Luria-Bertani) | Becton Dickinson | BD | |
| Difoco LB Broth, Miller (Luria-Bertani) | Becton Dickinson | 244610 | |
| DNA-free DNA Removal Kit | Thermo Fisher Scientific | 244510 | Dnase digestion |
| Dried yeast | Rapunzel | - | Organic cultivation |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS) | Thermo Fisher Scientific | 14040 | |
| Ethanol | VWR | 20821.330 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | W252506 | |
| Honey | Ostermühle Naturkost GmbH | 487 | |
| Isopropanol | VWR | 20842.330 | |
| Lightcycler 480 Instrument II | Roche Molecular Systems | 5015278001 | |
| LightCycler 480 Multiwell Plate 96, white | Roche Molecular Systems | 4729692001 | |
| Manual Microsyringe Pump with Digital Display | World Precision Instruments | DMP | |
| Micro-Fine+ U-100 insulin syringe 0.3 x 8 mm | Becton Dickinson | 324826 | Oral administration |
| Mortar, unglazed | VWR | 410-9327 | |
| Nanodrop | Thermo Fisher Scientific | 13-400-518 | |
| Nuclease-free water | Thermo Fisher Scientific | 10977035 | |
| Oxoid AnaeroGen sachets | Thermo Fisher Scientific | AN0025A | Quality and quantity of RNA |
| PCR stripes | Biozym | 710970 | |
| Pestle, unglazed grinding surface | VWR | 410-9324 | |
| Phusion proof-reading enzyme | Thermo Fisher Scientific | F553S | |
| Primers | Biomers | - | |
| PureYield Plasmid Miniprep System | Promega | A1222 | |
| QuantiFast SYBR Green PCR kit | Qiagen | 204056 | qPCR for bacterial copy number measurment |
| QuantiFast SYBR Green RT-PCR Kit | Qiagen | 204156 | qRT-PCR for gene expression measurements |
| QuantiTect Reverse Transcription Kit | Qiagen | 205311 | cDNA synthesis |
| Qubit Assay Tubes | Thermo Fisher Scientific | Q32856 | |
| Qubit dsHS DNA kit | Thermo Fisher Scientific | Q32851 | Quantification of plasmid and cDNA samples |
| Qubit fluorometer | Thermo Fisher Scientific | Q33226 | Quantification of plasmid and cDNA samples |
| RNase-ExitusPlus | AppliChem | A7153 | |
| Rnasin Ribonuclease Inhibitor | Promega | N2511 | |
| Skimmed milk powder | Sucofin | - | |
| SYBR safe DNA Gel Stain | Thermo Fisher Scientific | S33102 | |
| TRI reagent | Sigma-Aldrich | T9424 | |
| Weighing boat | VWR | 10803-148 | |
| Wheat meal | Ostermühle Naturkost GmbH | 6462 | Organic cultivation |
References
- Nell, S., Suerbaum, S., Josenhans, C. The impact of the microbiota on the pathogenesis of IBD: lessons from mouse infection models. Nature Reviews Microbiology. 8 (8), 564-577 (2010).
- Muniz, L. R., Knosp, C., Yeretssian, G. Intestinal antimicrobial peptides during homeostasis, infection, and disease. Frontiers in Immunology. 3, 310 (2012).
- Ivanov, I. I., Honda, K. Intestinal commensal microbes as immune modulators. Cell Host Microbe. 12 (4), 496-508 (2012).
- Ayres, J. S. Inflammasome-microbiota interplay in host physiologies. Cell Host Microbe. 14 (5), 491-497 (2013).
- Champion, O. L., Titball, R. W., Bates, S. Standardization of G. mellonella Larvae to Provide Reliable and Reproducible Results in the Study of Fungal Pathogens. Journal of Fungi (Basel). 4 (3), (2018).
- Wojda, I. Immunity of the greater wax moth Galleria mellonella. Insect Science. , (2016).
- Buchmann, K. Evolution of Innate Immunity: Clues from Invertebrates via Fish to Mammals. Frontiers in Immunology. 5, 459 (2014).
- Lange, A., et al. Galleria mellonella: A Novel Invertebrate Model to Distinguish Intestinal Symbionts From Pathobionts. Frontiers in Immunology. 9 (2114), (2018).
- Tsai, C. J., Loh, J. M., Proft, T. Galleria mellonella infection models for the study of bacterial diseases and for antimicrobial drug testing. Virulence. , 1-16 (2016).
- Bolouri Moghaddam, M. R., et al. The potential of the Galleria mellonella innate immune system is maximized by the co-presentation of diverse antimicrobial peptides. Biological Chemistry. 397 (9), 939-945 (2016).
- Casanova-Torres, A. M., Goodrich-Blair, H. Immune Signaling and Antimicrobial Peptide Expression in Lepidoptera. Insects. 4 (3), 320-338 (2013).
- Mukherjee, K., et al. Galleria mellonella as a model system for studying Listeria pathogenesis. Applied and Environmental Microbiology. 76 (1), 310-317 (2010).
- Brennan, M., Thomas, D. Y., Whiteway, M., Kavanagh, K. Correlation between virulence of Candida albicans mutants in mice and Galleria mellonella larvae. FEMS Immunological and Medical Microbiology. 34 (2), 153-157 (2002).
- Miyata, S., Casey, M., Frank, D. W., Ausubel, F. M., Drenkard, E. Use of the Galleria mellonella caterpillar as a model host to study the role of the type III secretion system in Pseudomonas aeruginosa pathogenesis. Infection and Immunity. 71 (5), 2404-2413 (2003).
- Waidmann, M., et al. Bacteroides vulgatus protects against Escherichia coli-induced colitis in gnotobiotic interleukin-2-deficient mice. Gastroenterology. 125 (1), 162-177 (2003).
- Lange, A., et al. Extensive Mobilome-Driven Genome Diversification in Mouse Gut-Associated Bacteroides vulgatus mpk. Genome Biology and Evolution. 8 (4), 1197-1207 (2016).
- Hermann-Bank, M. L., Skovgaard, K., Stockmarr, A., Larsen, N., Molbak, L. The Gut Microbiotassay: a high-throughput qPCR approach combinable with next generation sequencing to study gut microbial diversity. BMC Genomics. 14, 788 (2013).
- Sato, K., et al. OmpA variants affecting the adherence of ulcerative colitis-derived Bacteroides vulgatus. Journal of Medical and Dental Science. 57 (1), 55-64 (2010).
- Freitak, D., et al. The maternal transfer of bacteria can mediate trans-generational immune priming in insects. Virulence. 5 (4), 547-554 (2014).
- Pfaffl, M. W. A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR. Nucleic Acids Research. 29 (9), 45 (2001).
- Ramarao, N., Nielsen-Leroux, C., Lereclus, D. The insect Galleria mellonella as a powerful infection model to investigate bacterial pathogenesis. Journal of Visualized Experiments. (70), e4392 (2012).
- Ramarao, N., Nielsen-Leroux, C., Lereclus, D. The insect Galleria mellonella as a powerful infection model to investigate bacterial pathogenesis. Journal of Visualized Experiments. (70), e4392 (2012).
