Um modelo de administração Oral Galleria mellonella para respostas imunes Study Commensal-Induced inata

Summary

Aqui, nós fornecemos um protocolo detalhado para um modelo de administração oral usando Galleria mellonella larvas e como caracterizar induzido inatas respostas imunes. Usando este protocolo, será capazes de usar a alimentação forçada método mellonella g. pesquisadores sem experiência prática.

Abstract

A investigação do potencial imunogênico de bactérias comensais sobre o sistema imunológico do hospedeiro é um componente essencial ao estudar interações do anfitrião-micróbio intestinal. Está bem estabelecido que os comensais diferentes apresentam um potencial diferente para estimular o sistema imunitário intestinal do hospedeiro. Tais investigações envolvem animais vertebrados, especialmente roedores. Que crescentes preocupações éticas estão relacionadas com a realização de experiências com vertebrados, existe uma alta demanda por modelos de invertebrados substituições.

Aqui, nós fornecemos um modelo de administração oral de Galleria mellonella usando bactérias não-patogênicas são comensais e a possível avaliação do potencial imunogênico de comensais no sistema imunitário mellonella g. . Demonstramos que mellonella g. é um modelo de substituição de invertebrados alternativa útil que permite a análise dos comensais com potencial imunogênico diferente tais como Bacteroides vulgatus e Escherichia coli. Curiosamente, as bactérias não exibiram nenhum efeito sobre as larvas, que é semelhante para os mamíferos. As respostas imunes de g. mellonella eram comparáveis com respostas de imunes inatas vertebradas e envolvem a produção de moléculas antimicrobianas e reconhecimento das bactérias. Propomos que mellonella g. foi capaz de restaurar o equilíbrio anterior de microbiota, que é bem conhecido de indivíduos saudáveis de mamíferos. Apesar de fornecer respostas de imune inatas comparáveis em vertebrados e mellonella g. , g. mellonella não abriga um sistema imune adaptativo. Desde que os investigados componentes do sistema imunitário inato são evolutivos conservada, o modelo permite uma análise prescreening e primeira de propriedades imunogênicas bacterianas.

Introduction

A microbiome intestinal é um componente essencial para a manutenção da homeostase e envolve ambas as respostas de imune inata e adaptativa^1,2. A Comunidade microbiota comensal é caracterizada por diferentes componentes principais de comensais: simbiontes que conferem efeitos benéficos por funções immunomodulatory importante e pathobionts que pode ter efeitos prejudiciais geneticamente predispostos hospeda e promover e provocar inflamação intestinal^3,4. Muitos estudos sobre simbiontes e pathobionts e sua influência sobre o sistema imunológico do hospedeiro têm sido publicados principalmente estudar respostas imunes adaptáveis.

Uma vez que estes estudos envolvem muitos animais para as investigações e a proteção e a substituição dos animais utilizados para experimentação é de aumentar o interesse público, buscamos encontrar um modelo de substituição para permitir a exibição de diferentes bactérias imunogênicas Propriedades. Insetos, especialmente Galleria mellonella, são um modelo de substituição amplamente utilizado na investigação de infecção. G. mellonella combina diferentes vantagens como baixo custo e alto rendimento; Ele permite que a administração oral de bactérias, que é a rota de exposição natural, e permite a infecção sistêmica^5,6. G. mellonella mais permite a incubação a 37 ° C, qual é a temperatura do corpo fisiológico de mamíferos e o ideal para o factor de virulência bacteriana expressão⁵. A principal vantagem do mellonella g. é conservado sistema imunitário inato que permite a discriminação do self da não-auto e codifica uma variedade de receptores de reconhecimento padrão como apolipophorin ou o opsoninas hemolin^{6, 7}. sobre reconhecimento de micróbio, g. mellonella pode desencadear respostas diferentes a jusante imune humorais. Pode induzir respostas de estresse oxidativo e secretam espécies reativas de oxigênio (ROS), que envolve a atividade de n º s (oxidase nítrico sintase) e NOX (oxidase de NADPH)^6,8. Além disso, g. mellonella ativa uma resposta potente peptídeo antimicrobiano (AMP), que resulta na secreção de uma mistura de AMPs diferentes tais como gloverin, moricin, Cecropina ou o defensina-como gallerimycin^{6, 8,9,10}. Geralmente, amplificadores têm bastante amplo acolhimento especificidade contra bactérias gram-positivas e Gram-negativas e fungos e tem que dar uma resposta potente, desde que os insetos estão faltando qualquer resposta adaptativa¹⁰. Gloverin é um amplificador ativo contra bactérias e fungos e inibe a formação de membrana exterior^6,11. Moricins exibem sua função antimicrobiana contra bactérias gram-positivas e Gram-negativas por penetrar a membrana e formando um poro^9,11. Cecropins fornecer atividade contra bactérias e fungos e permeabilize a membrana da mesma forma como moricins^9,10. Gallerimycin é um peptídeo de defensina-como com propriedades anti-fúngicos⁹. Curiosamente, verificou-se que a combinação de Cecropina e gallerimycin tinha uma atividade sinérgica contra e. coli¹⁰.

Devido ao seu caráter de easy-to-use mellonella g. as larvas são um modelo de infecção frequentemente usados para avaliar a patogenicidade bacteriana. Em particular, estudos em que dados obtidos de g. mellonella correlacionam com dados obtidos de ratos apoio a força deste modelo hospedeiro alternativo. Verificou-se que os serótipos mais patogênicos de Listeria monocytogenes em um modelo de infecção do rato também conduzem a maiores taxas de mortalidade em g. mellonella após infecção sistêmica. Além disso, menos serotipos virulentos acabou por ser também menos virulentos no modelo mellonella g. ¹². Observações semelhantes foram feitas com os fungos patogênicos humanos Candida albicans. Virulência de c. albicans de diferentes estirpes tenha sido avaliada por infecção sistêmica e posterior acompanhamento de sobrevivência larval. Cepas avirulentas mouse também foram expostas ou avirulentas reduzida virulência em g. mellonella, Considerando que as estirpes virulentas rato conduzem também a alta mortalidade larval¹³. O modelo de g. mellonella mais poderia ser usado para identificar fatores de patogenicidade de sistema tipo 3 secreção de Pseudomonas aeruginosa¹⁴.

Desde que a maioria das investigações que envolvem mellonella g. concentraram-se em fatores de virulência usando a abordagem de infecção sistêmica estávamos especialmente interessados em fornecer um método adequado para a análise dos comensais intestinais em uma alimentação oral forçada modelo em que podemos aplicar uma dosagem distinta de bactérias por larvas e não apenas observar a taxa de mortalidade larval mas analisar diferentes marcas da inatas respostas imunes para manter a homeostase intestinal.

Nosso método ajuda a aumentar o uso de g. mellonella como um modelo de substituição, desde que combinamos a aplicação de bactérias e a análise da expressão do RNA. Não só é útil reforçar o significado dos estudos de patogênese bacteriana quando incluindo a análise das respostas imunes após administração oral e não apenas a observação das taxas de mortalidade após infecção sistêmica. Nossos métodos permite que para a análise das propriedades imunogênicas de bactérias não-patogênicas comensais desde que é fornece condições mais complexas do que a cultura celular, oferecendo uma barreira intestinal em um organismo vivo.

Protocol

1. mellonella g. criação e preparação das larvas para os experimentos Nota: O ciclo de ovo a último ínstar larva leva aproximadamente 5-6 semanas. Transferi os ovos postos pelas traças adultas para caixas de 2 L, contendo substrato traça da cera (grãos de milho 22%, 22% de farelo de trigo, 17,5% cera de abelha, 11% leite em pó desnatado, mel de 11%, 11% de glicerol, 5,5% secada levedura). Execute toda a criação a 30 ° C, no escuro. Transferi 25 g de su…

Representative Results

O modelo de infecção de hemolinfa mellonella g. em amplamente utilizado para analisar os fatores de virulência de uma enorme variedade de agentes patogénicos. A maioria das medições incluem a análise da mortalidade de larvas, que é um método muito fácil. No entanto, esse método não permitem conclusões sobre respostas imunes em geral e vincular os resultados das respostas imunes de g. mellonella com vertebrados mecanismos imunes. O modelo de administração o…

Discussion

O modelo de g. mellonella é um modelo frequentemente usado para avaliar os fatores de virulência bacteriana em uma abordagem de infecção sistêmica²¹. Desde que muitos patógenos e bactérias entrarem o hospedeiro através da rota de colonização ou infecção oral, novos insights precisam ser encontrado para avaliar mellonella g. como um modelo para a colonização oral e infecção.

A possibilidade de traseira mellonella g. entre 15 e 3…

Materials

1.5 mL tubes	Eppendorf	0030120086
100 bp DNA ladder	Thermo Fisher Scientific	15628019
1-Bromo-3-Chloropropane (BCP)	Sigma-Aldrich	B9673
2 mL tubes	Eppendorf	0030120094
2x Mangomix	Bioline	BIO-25033	Colony PCR
50 mL tubes	Greiner Bio-One	210 261
Agarose	Biozym	840004
Beeswax	Mixed-Store.de	-
Brain heart infusion broth	Thermo Fisher Scientific	CM1135
CloneJET PCR Cloning Kit	Thermo Fisher Scientific	K1232	Cloning vector for 16S fragments
Corn grits	Ostermühle Naturkost GmbH	306	Organic cultivation
Difco LB Agar, Miller (Luria-Bertani)	Becton Dickinson	BD
Difoco LB Broth, Miller (Luria-Bertani)	Becton Dickinson	244610
DNA-free DNA Removal Kit	Thermo Fisher Scientific	244510	Dnase digestion
Dried yeast	Rapunzel	-	Organic cultivation
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS)	Thermo Fisher Scientific	14040
Ethanol	VWR	20821.330
Glycerol	Sigma-Aldrich	W252506
Honey	Ostermühle Naturkost GmbH	487
Isopropanol	VWR	20842.330
Lightcycler 480 Instrument II	Roche Molecular Systems	5015278001
LightCycler 480 Multiwell Plate 96, white	Roche Molecular Systems	4729692001
Manual Microsyringe Pump with Digital Display	World Precision Instruments	DMP
Micro-Fine+ U-100 insulin syringe 0.3 x 8 mm	Becton Dickinson	324826	Oral administration
Mortar, unglazed	VWR	410-9327
Nanodrop	Thermo Fisher Scientific	13-400-518
Nuclease-free water	Thermo Fisher Scientific	10977035
Oxoid AnaeroGen sachets	Thermo Fisher Scientific	AN0025A	Quality and quantity of RNA
PCR stripes	Biozym	710970
Pestle, unglazed grinding surface	VWR	410-9324
Phusion proof-reading enzyme	Thermo Fisher Scientific	F553S
Primers	Biomers	-
PureYield Plasmid Miniprep System	Promega	A1222
QuantiFast SYBR Green PCR kit	Qiagen	204056	qPCR for bacterial copy number measurment
QuantiFast SYBR Green RT-PCR Kit	Qiagen	204156	qRT-PCR for gene expression measurements
QuantiTect Reverse Transcription Kit	Qiagen	205311	cDNA synthesis
Qubit Assay Tubes	Thermo Fisher Scientific	Q32856
Qubit dsHS DNA kit	Thermo Fisher Scientific	Q32851	Quantification of plasmid and cDNA samples
Qubit fluorometer	Thermo Fisher Scientific	Q33226	Quantification of plasmid and cDNA samples
RNase-ExitusPlus	AppliChem	A7153
Rnasin Ribonuclease Inhibitor	Promega	N2511
Skimmed milk powder	Sucofin	-
SYBR safe DNA Gel Stain	Thermo Fisher Scientific	S33102
TRI reagent	Sigma-Aldrich	T9424
Weighing boat	VWR	10803-148
Wheat meal	Ostermühle Naturkost GmbH	6462	Organic cultivation