Полупроводниковое секвенирование для предимплантационного генетического тестирования на анеуплоидию
Summary
Здесь мы внедряем метод секвенирования полупроводников для предимплантационного генетического тестирования на анеуплоидию (PGT-A) с преимуществами короткого оборота времени, низкой стоимости и высокой пропускной способности.
Abstract
Хромосомная анеуплоидия, одна из основных причин, приводящих к остановке эмбрионального развития, отказу имплантации или потере беременности, хорошо задокументирована в человеческих эмбрионах. Предимплантационное генетическое тестирование на анеуплоидию (PGT-A) является генетическим тестом, который значительно улучшает репродуктивные результаты путем выявления хромосомных аномалий эмбрионов. Секвенирование нового поколения (NGS) обеспечивает высокопроизводительный и экономичный подход к генетическому анализу и показало клиническую применимость в PGT-A. Здесь мы представляем быстрый и недорогой полупроводниковый метод NGS для скрининга анеуплоидии у эмбрионов. Первым шагом рабочего процесса является усиление всего генома (WGA) биопсиального образца эмбриона с последующим строительством библиотеки секвенирования и последующим секвенированием по полупроводниковой системе секвенирования. Как правило, для приложения PGT-A 24 образца могут быть загружены и секвенированы на каждом чипе, генерирующем 60-80 миллионов считываний при средней длине чтения 150 базовых пар. Метод обеспечивает усовершенствованный протокол для выполнения усиления шаблона и обогащения библиотеки секвенирования, что делает обнаружение PGT-A воспроизводимым, высокопроизводительным, экономичным и экономичным временем. Время работы этого полупроводникового секвенсора составляет всего 2–4 часа, что сокращает время оборота от получения образцов до выдачи отчетов в течение 5 дней. Все эти преимущества делают этот ассси идеальным методом обнаружения хромосомных анеуплоидий из эмбрионов и, таким образом, облегчают его широкое применение в PGT-A.
Introduction
Выбор качественных жизнеспособных эмбрионов с нормальными номерами копий хромосом (euploid) для передачи вспомогательной репродукции помогает улучшить исходы беременности. Традиционно, хорошо зарекомендовавшая себя система морфологического сортировки широко используется для оценки эмбрионов из-за его легкой доступности и неинвазивного характера. Тем не менее, было показано, что морфологическая оценка может предоставить только ограниченную информацию о качестве эмбриона1 и потенциал имплантации2. Одной из основных причин является его неспособность в оценке хромосомного состава эмбрионов.
Хромосомная анеуплоидия (аномальная копия числа хромосом) является одной из основных причин, приводящих к остановке эмбрионального развития, отказу имплантации или потере беременности. Возникновение анеуплоидии было хорошо задокументировано в человеческих эмбрионах, что составляет60%-70% в эмбрионах стадии расщепления 3,4 и 50%-60% в бластоцистах5. Это, в некоторой степени, способствовало узкое место в улучшении беременности скорость в пробирке оплодотворения (ЭКО) лечение, которое поддерживается на уровне около 35% и 40%6,7. Таким образом, выбор euploid эмбрионов для передачи считается полезным для улучшения исходов беременности. С этой целью, предимплантационное генетическое тестирование на анеуплоидию (PGT-A) было дополнительно разработано для исследования жизнеспособности эмбриона с использованием генетических подходов. Растет число рандомизированных контролируемых исследований и когортных исследований, поддерживающих решающую роль PGT-A. Было доказано, что применение PGT-A снижает частоту выкидыша и увеличивает уровень клинической беременности и имплантацииставка 8, текущий уровень беременности и живой коэффициент рождаемости9.
Исторически сложилось так, что в PGT-A применялись различные методы, такие как флуоресценция на месте гибридизации (FISH), сравнительная геномная гибридизация (CGH), массив-CGH и одиннуклеотидный полиморфизм (SNP)-microarray. Предыдущие исследования показали, что PGT-A для декольте стадии эмбрионов FISH дает результаты, которые плохо согласуются с теми, которые получены путем комплексного хромосомного скрининга (CCS) соответствующих бластоцикторов с использованием 59273array-CGH или SNP-microarray5927310. Эти расхождения можно отнести к хромосомной мозаизме, техническим артефактам FISH или эмбриональной самокоррекции хромосомных ошибок сегрегации при разработке11. Было широко признано, что использование бластоциста трофиктодерма (TE) биопсии для массива на основе PGT-A, таких как массив-CGH или SNP-microarray является эффективным для выявления хромосомного дисбаланса в эмбрионах10,12. В последнее время одноклеточный секвенирование нового поколения (NGS) обеспечивает высокопроизводительный и экономичный подход к генетическому анализу и показало клиническую применимость в PGT-A13,14,15, которые делают его перспективная альтернатива имеющимся в настоящее время методам.
Здесь мы представляем быстрый, надежный и недорогой полупроводниковый метод секвенирования NGS для скрининга анеуплоидии в человеческих эмбрионах. Первым шагом рабочего процесса является усиление всего генома (WGA) биопсии образца эмбриона, с использованием одноклеточного набора WGA, с последующим строительством библиотеки секвенирования и последующим секвенированием полупроводниковой системы секвенирования.
Путем обнаружения ионов H и, которые высвобождаются от каждого дезоксирибонуклеосайдтрифосфата инкорпорации во время синтеза нити ДНК, система передает химические сигналы (изменение рН), захваченных полупроводниковых элементов для направления цифровых данных , которые дополнительно интерпретируются в информацию о последовательности ДНК. Устраняя потребность в дорогостоящем оптическом обнаружении и сложных реакциях секвенирования, эта простая химия секвенирования снижает общую стоимость реагента и сокращает время секвенирования на 2–4 часа16. Что еще более важно, на основе спецификаций производительности производителя, полупроводниковая платформа секвенирования может генерировать до 15 ГБ данных секвенирования (зависит от качества библиотеки) за пробег, что значительно выше, чем некоторые другие секвенсоры производство только около 3’4 ГБ данных (с 2 х 75 bp читать длиной)17. В клинических приложениях PGT-A, эта платформа может достичь 24 образцов на чип генерации до 80 миллионов считывает17 и по крайней мере один миллион уникальных считываний каждого образца. Глубина чтения может гарантировать, что каждый образец имеет по крайней мере 0,05x весь охват генома. Вышеперечисленные преимущества этой платформы делают ее идеальным методом скрининга и, таким образом, облегчают его широкое применение в PGT-A18.
Protocol
Representative Results
Discussion
В отличие от других секвенирующих химий, описанный здесь секвенсор использует полупроводник для обнаружения нуклеотидов. Чип сам по себе представляет собой электронное устройство, которое обнаруживает ионы водорода с помощью основанного на полимеразе основание17, которо…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Это исследование было поддержано Генеральным исследовательским фондом (Ref No 14162417) из Гонконга, Национальным фондом естественных наук Китая (Ref No 81860272), Основным исследовательским планом Провинциального научно-технического фонда Гуанси (Ref No. AB16380219) и Грант Китайского фонда постдокторской науки (Ref No 2018M630993) из Китая.
Materials
| PCR tubes, 0.2 mL | Axygen | PCR-02D-C | |
| UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0 | ThermoFisher | 15575020 | |
| PBS, pH 7.4, Ca2+ and Mg2+ free | ThermoFisher | 10010023 | |
| 1.0 M NaOH (1.0N) solution | SIGMA-ALDRICH | S2567 | For Melt-off solution. Molecular grade |
| Eppendorf LoBind Tubes, 1.5 mL | Fisher Scientific | 13-698-791 | |
| Ion Plus Fragment Library Kit | ThermoFisher | 4471252 | |
| ELGA PURELAB Flex 3 Water Purification System or Equivalent 18 MΩ water system |
ThermoFisher | 4474524 | |
| Ion Plus Fragment Library Kit | ThermoFisher | 4471252 | |
| PicoPLEX WGA Amplification buffer | Rubicon Genomics | R30050 | This can be replaced by SurePlex DNA Amplification System,catalog number: PR-40-415101-03. |
| PicoPLEX WGA Amplification enzyme | Rubicon Genomics | R30050 | This can be replaced by SurePlex DNA Amplification System,catalog number: PR-40-415101-03. |
| Ion OneTouch Amplification Plate | In kit: Ion OneTouch 2 Supplies (Part No. A26367). Extended kit component in Sheet 5 | ||
| Ion PI Annealing Buffer | |||
| MyOne Beads Capture Solution | |||
| Agilent 2100 Bioanalyzer instrument | Agilent | G2939AA | |
| Ion OneTouch Breaking Solution (black cap) | In kit: Ion PI Hi‑Q OT2 Solutions 200 (Part No. A26429). Extended kit component in Sheet 5 | ||
| Dynabeads MyOne Streptavidin C1 | ThermoFisher | 65001 | |
| PicoPLEX WGA Cell extraction buffer | Rubicon Genomics | R30050 | This can be replaced by SurePlex DNA Amplification System,catalog number: PR-40-415101-00. |
| PicoPLEX WGA Cell extraction enzyme | Rubicon Genomics | R30050 | This can be replaced by SurePlex DNA Amplification System,catalog number: PR-40-415101-03. |
| Ion PI Chip Kit v3 | ThermoFisher | A26771 | |
| Ion Chip Minifuge, 230 V | ThermoFisher | 4479673 | |
| Ion PI dATP | ThermoFisher | A26772 | |
| Ion PI dCTP | ThermoFisher | A26772 | |
| Ion PI dGTP | ThermoFisher | A26772 | |
| Ion Plus Fragment Library Kit | ThermoFisher | 4471252 | |
| Ion Plus Fragment Library Kit | ThermoFisher | 4471252 | |
| ThermoQ–Temperature Dry Bath | TAMAR | HB-T2-A | |
| NEBNext dsDNA Fragmentase | New England Biolabs | M0348L | |
| NEBNext dsDNA Fragmentase | New England Biolabs | M0348L | |
| Ion PI dTTP | ThermoFisher | A26772 | |
| Ion OneTouch 2 Instrument | ThermoFisher | INS1005527 | ThermoFisher Catalog number: 4474778. |
| Ion Plus Fragment Library Kit | ThermoFisher | 4471252 | |
| Ion One Touch ES | ThermoFisher | 8441-22 | ThermoFisher Catalog number: 4469495. Extended kit component in Sheet 5 |
| Ethanol | SIGMA-ALDRICH | 51976 | This can be replaced by any brand's molecular grade absolute ethanol. |
| PicoPLEX WGA Extraction enzyme dilution buffer | Rubicon Genomics | R30050 | This can be replaced by SurePlex DNA Amplification System,catalog number: PR-40-415101-01. |
| PicoPLEX WGA Extraction enzyme dilution buffer | Rubicon Genomics | R30050 | This can be replaced by SurePlex DNA Amplification System,catalog number: PR-40-415101-02. |
| Qubit 3.0 Fluorometer | ThermoFisher | Q33216 | This model has been replaced by Qubit 4 Fluorometer, Catalog number: Q33226. |
| Qubit ds DNA HS Assay kit | ThermoFisher | M2002-02 | |
| Qubit Assay Tubes | ThermoFisher | Q32856 | |
| Ion PI Foaming Solution | ThermoFisher | A26772 | |
| Index for barcoding of libraries | BaseCare | this is a in-house prepared index. Users can buy commercial product from ThermoFisher Ion Xpress Barcode Adapters Kits (Cat. No. 4474517) | |
| Ion PI Loading Buffer | ThermoFisher | A26772 | |
| Solid(TM) Buffer Kit-1X Low TE Buffer | ThermoFisher | 4389764 | |
| Agencour AMPure XP Kit | Beckman Coulter | A63880 | |
| DynaMag-2 magnet (magnetic rack) | ThermoFisher | 12321D | |
| Ion PI Master Mix PCR buffer | |||
| Sorvall Legend Micro 17 Microcentrifuge | Micro 17 | 75002430 | |
| Ion Plus Fragment Library Kit | ThermoFisher | 4471252 | |
| Nuclease-free water | ThermoFisher | AM9922 | This can be replaced by other brand. |
| PicoPLEX WGA Nuclease-free water | Rubicon Genomics | R30050 | This can be replaced by SurePlex DNA Amplification System,catalog number: PR-40-415101-03. |
| Ion OneTouch Oil bottle | Ion PI Hi‑Q OT2 Solutions 200 (Part No. A26429). Extended kit component in Sheet 5 | ||
| Ion Plus Fragment Library Kit | ThermoFisher | 4471252 | Extended kit component in Sheet 3 |
| double-strand DNA standard | This is a in-house prepared DNA standard for calibration of Qubit before quantification of library. | ||
| PicoPLEX WGA Preamplification buffer | Rubicon Genomics | R30050 | This can be replaced by SurePlex DNA Amplification System,catalog number: PR-40-415101-03. |
| PicoPLEX WGA Preamplification enzyme | Rubicon Genomics | R30050 | This can be replaced by SurePlex DNA Amplification System,catalog number: PR-40-415101-03. |
| Library Amplification Primer Mix | ThermoFisher | 4471252 | Extended kit component in Sheet 3 |
| Ion OneTouch Reaction Filter | Extended kit component in Sheet 5 | ||
| Recovery Router | Extended kit component in Sheet 5 | ||
| Recovery Tubes | Extended kit component in Sheet 5 | ||
| ISP Resuspension Solution | |||
| Ion Proton | ThermoFisher | DA8600 | This model is imported by Da An Gene Co.,LTD. of Sun Yat-Sen University from ThermoFisher and has been certified by China Food and Drug Administration for clinical application. The catalog number in ThermoFisher is 4476610. |
| Ion PI Hi‑Q Sequencing Polymerase | ThermoFisher | A26772 | |
| Ion PI Sequencing Primer | |||
| server for sequencer | Lenovo | T260 | |
| Ion PI Sphere Particles | |||
| Platinum PCR SuperMix High Fidelity | ThermoFisher | 4471252 | |
| Nalgene 25mm Syringe Filters | ThermoFisher | 724-2045 | Pore size: 0.45μm. Specifically for aqueous fluids. |
| Ion PI Hi‑Q W2 Solution | ThermoFisher | A26772 | |
| Ion PI 1X W3 Solution | ThermoFisher | A26772 | |
| Ion OneTouch Wash Solution C1 | |||
| The Ion PGM Hi‑Q View Sequencing Kit | ThermoFisher | A30044 | Extended kit component in Sheet 2 |
| Ion Plus Fragment Library Kit | ThermoFisher | 4471252 | Extended kit component in Sheet 3 |
| Ion PI Hi-Q Sequencing 200 Kit (1 sequencing run per initialization) | ThermoFisher | A26772 | Extended kit component in Sheet 4 |
| Ion PI Hi‑Q OT2 200 Kit | ThermoFisher | A26434 | Extended kit component in Sheet 5 |
References
- Balaban, B., Urman, B. Effect of oocyte morphology on embryo development and implantation. Reproductive BioMedicine Online. 12 (5), 608-615 (2006).
- Capalbo, A., et al. Correlation between standard blastocyst morphology, euploidy and implantation: An observational study in two centers involving 956 screened blastocysts. Human Reproduction. 29 (6), 1173-1181 (2014).
- Magli, M. C., Gianaroli, L., Ferraretti, A. P. Chromosomal abnormalities in embryos. Molecular and Cellular Endocrinology. 183, 29-34 (2001).
- Trussler, J. L., Pickering, S. J., Ogilvie, C. M. Investigation of chromosomal imbalance in human embryos using comparative genomic hybridization. Reproductive BioMedicine Online. 8 (6), 701-711 (2004).
- Fragouli, E., et al. Cytogenetic analysis of human blastocysts with the use of FISH, CGH and aCGH: Scientific data and technical evaluation. Human Reproduction. 26 (2), 480-490 (2011).
- Calhaz-Jorge, C., et al. Assisted reproductive technology in Europe, 2013: Results generated from European registers by ESHRE. Human Reproduction. 32 (10), 1957-1973 (2017).
- Dyer, S., et al. International committee for monitoring assisted reproductive technologies world report: Assisted reproductive technology 2008, 2009 and 2010. Human Reproduction. 31 (7), 1588-1609 (2008).
- Dahdouh, E. M., Balayla, J., García-Velasco, J. A. Comprehensive chromosome screening improves embryo selection: A meta-analysis. Fertility and Sterility. 104 (6), 1503-1512 (2015).
- Chen, M., Wei, S., Hu, J., Quan, S. Can Comprehensive Chromosome Screening Technology Improve IVF/ICSI Outcomes? A Meta-Analysis. PloS One. 10 (10), e0140779 (2015).
- Northrop, L. E., Treff, N. R., Levy, B., Scott, J. T. SNP microarray-based 24 chromosome aneuploidy screening demonstrates that cleavage-stage FISH poorly predicts aneuploidy in embryos that develop to morphologically normal blastocysts. Molecular Human Reproduction. 16 (8), 590-600 (2010).
- Barbash-Hazan, S., et al. Preimplantation aneuploid embryos undergo self-correction in correlation with their developmental potential. Fertility and Sterility. 92 (3), 890-896 (2009).
- Fragouli, E., et al. Comprehensive cytogenetic analysis of the human blastocyst stage. Fertility and Sterility. 90 (11), S36 (2008).
- Fiorentino, F., et al. Development and validation of a next-generation sequencing-based protocol for 24-chromosome aneuploidy screening of embryos. Fertility and Sterility. 101 (5), 1375-1382 (2014).
- Fiorentino, F., et al. Application of next-generation sequencing technology for comprehensive aneuploidy screening of blastocysts in clinical preimplantation genetic screening cycles. Human Reproduction. 29 (12), 2802-2813 (2014).
- Wells, D., et al. Clinical utilisation of a rapid low-pass whole genome sequencing technique for the diagnosis of aneuploidy in human embryos prior to implantation. Journal of Medical Genetics. 51 (8), 553-562 (2014).
- Quail, M. A., et al. A tale of three next generation sequencingplatforms: comparison of Ion Torrent, PacificBiosciences and Illumina MiSeq sequencers. BMC Genomics. 13 (1), 1-13 (2012).
- Goodwin, S., McPherson, J. D., McCombie, W. R. Coming of age: ten years of next-generation sequencing technologies. Nature Reviews Genetics. 17 (6), 333-351 (2016).
- Bono, S., et al. Validation of a semiconductor next-generation sequencing-based protocol for preimplantation genetic diagnosis of reciprocal translocations. Prenatal Diagnosis. 35 (10), 938-944 (2015).
- Harton, G. L., et al. ESHRE PGD Consortium/Embryology Special Interest Groupbest practice guidelines for polar body and embryo biopsy for preimplantation genetic diagnosis/screening (PGD/PGS). Human Reproduction. 26 (1), 41-46 (2011).
- Liu, W. Q., et al. The performance of MALBAC and MDA methods in the identification of concurrent mutations and aneuploidy screening to diagnose beta-thalassaemia disorders at the single- and multiple-cell levels. Journal of Clinical Laboratory Analysis. 32 (2), 1-8 (2018).
- Zhang, X., et al. The comparison of the performance of four whole genome amplification kits on ion proton platform in copy number variation detection. Bioscience Reports. 37 (4), BSR20170252 (2017).
- Munné, S., Grifo, J., Wells, D. Mosaicism: “survival of the fittest” versus “no embryo left behind”. Fertility and Sterility. 105 (5), 1146-1149 (2016).
- Del Carmen Nogales, M., et al. Type of chromosome abnormality affects embryo morphology dynamics. Fertility and Sterility. 107 (1), 229-235 (2017).
- Harton, G. L., et al. ESHRE PGD consortium best practice guidelines for amplification-based PGD. Human Reproduction. 26 (1), 33-40 (2011).
- Deleye, L., et al. Shallow whole genome sequencing is well suited for the detection of chromosomal aberrations in human blastocysts. Fertility and Sterility. 104 (5), 1276-1285 (2015).
- Bielanska, M., Tan, S. L., Ao, A. Chromosomal mosaicism throughout human preimplantation development in vitro: incidence, type, and relevance to embryo outcome. Human Reproduction. 17 (2), 413-419 (2002).
- Treff, N. R., et al. Evaluation of targeted next-generation sequencing-based preimplantation genetic diagnosis of monogenic disease. Fertility and Sterility. 99 (5), 1377-1384 (2013).
