Sequenziamento dei semiconduttori per il test genetico preimpianto per l'aneuplodia
Summary
Qui, introduciamo un metodo di sequenziamento dei semiconduttori per il test genetico preimpianto per l’aneeuploidy (PGT-A) con i vantaggi di tempi di consegna brevi, bassi costi e alta produttività.
Abstract
L’aneuploidia cromosomica, una delle principali cause che portano all’arresto dello sviluppo embrionale, al fallimento dell’impianto o alla perdita della gravidanza, è stata ben documentata negli embrioni umani. Il test genetico preimpianto per l’aneuploidia (PGT-A) è un test genetico che migliora significativamente i risultati riproduttivi rilevando anomalie cromosomiche degli embrioni. Il sequenziamento di nuova generazione (NGS) fornisce un approccio ad alto valore avanzato ed economico per l’analisi genetica e ha dimostrato l’applicabilità clinica in PGT-A. Qui, presentiamo un metodo NGS a base di semiconduttori rapido e a basso costo per lo screening dell’aneeuploidia negli embrioni. Il primo passo del flusso di lavoro è l’amplificazione dell’intero genoma (WGA) del campione di embrioni biopsied, seguita dalla costruzione della libreria di sequenziamento e dal successivo sequenziamento sul sistema di sequenziamento dei semiconduttori. Generalmente, per un’applicazione PGT-A, 24 campioni possono essere caricati e sequenziati su ogni chip generando 60-80 milioni di letture ad una lunghezza di lettura media di 150 coppie di base. Il metodo fornisce un protocollo raffinato per l’esecuzione di amplificazione del modello e l’arricchimento della libreria di sequenziamento, rendendo il rilevamento PGT-A riproducibile, ad alta produttività, conveniente e risparmio di tempo. Il tempo di esecuzione di questo sequencer a semiconduttore è di sole 2 o 4 ore, riducendo il tempo di consegna dalla ricezione di campioni all’emissione di rapporti in 5 giorni. Tutti questi vantaggi rendono questo saggio un metodo ideale per rilevare aneuploidi cromosomici da embrioni e quindi facilitare la sua ampia applicazione in PGT-A.
Introduction
La scelta di embrioni vitali di buona qualità con numeri di copia cromosomica normale (euploide) per il trasferimento nella riproduzione assistita aiuta a migliorare gli esiti della gravidanza. Tradizionalmente, il sistema di classificazione morfologica ben consolidato è ampiamente utilizzato per la valutazione degli embrioni a causa della sua facile disponibilità e della natura non invasiva. Tuttavia, è stato dimostrato che la valutazione morfologica può fornire solo informazioni limitate sulla qualità dell’embrione1 e sul potenziale di impianto2. Una ragione fondamentale è la sua incapacità di valutare la composizione cromosomica degli embrioni.
L’aneuploidia cromosomica (numero di copie anomale di cromosomi) è una delle principali cause che portano all’arresto dello sviluppo embrionale, al fallimento dell’impianto o alla perdita della gravidanza. L’insorgenza di aneuploidia è stata ben documentata negli embrioni umani, che rappresentail 60%,70% negli embrioni in fase di scissione 3,4 e 50%-60% nelle blastocisti5. Questo, in una certa misura, ha contribuito al collo di bottiglia nel miglioramento del tasso di gravidanza del trattamento di fecondazione in vitro (IVF), che ha mantenuto a circa il 35%,40%6,7. Pertanto, la selezione di embrioni euploidi per il trasferimento è creduta per essere utile per migliorare gli esiti della gravidanza. A tal fine, sono stati ulteriormente sviluppati test genetici preimpianto per l’aneuploidia (PGT-A) per studiare la vitalità degli embrioni utilizzando approcci genetici. Ci sono un numero crescente di studi controllati randomizzati e studi di coorte che supportano il ruolo cruciale di PGT-A. È stato dimostrato che l’applicazione di PGT-A riduce il tasso di aborto spontaneo e aumenta il tasso di gravidanza clinica e il tasso di impianto8, tasso di gravidanza in corso e tasso di natalità vivo9.
Storicamente, diversi metodi sono stati applicati in PGT-A, come la fluorescenza nell’ibridazione situ (FISH), l’ibridazione genomica comparativa (CGH), l’ibridazione genomica comparativa (CGH), la cGH di array e il polimorfismo a singolo nucleotide (SNP)-microarray. Studi precedenti hanno indicato che PGT-A per gli embrioni in fase di scissione di FISH produce risultati scarsamente coerenti con quelli ottenuti dallo screening cromosomico completo (CCS) delle blastocisti corrispondenti utilizzando 59273array-CGH o SNP-microarray5927310. Queste discrepanze possono essere attribuite al mosaicismo cromosomico, ai manufatti tecnici FISH o all’autocorrezione embrionale degli errori di segregazione cromosomica durante lo sviluppo11. È stato ampiamente riconosciuto che l’utilizzo di biopsie del trophectoderm blastocistico (TE) per PGT-A basati su array come array-CGH o SNP-microarray è efficace per identificare lo squilibrio cromosomico negli embrioni10,12. Recentemente, il sequenziamento di nuova generazione a cella singola (NGS) fornisce un approccio ad alta produttività ed economico per l’analisi genetica e ha dimostrato l’applicabilità clinica in PGT-A13,14,15, che lo rendono un approccio promettente alternativa ai metodi attualmente disponibili.
Qui, presentiamo un metodo NGS basato su semiconduttori veloce, robusto e a basso costo per lo screening dell’aneuploidia negli embrioni umani. Il primo passo del flusso di lavoro è l’amplificazione dell’intero genoma (WGA) del campione di embrioni biopsied, utilizzando un kit WGA a cella singola, seguito dalla costruzione della libreria di sequenziamento e dal successivo sequenziamento sul sistema di sequenziamento dei semiconduttori.
Attraverso il rilevamento degliioni H che vengono rilasciati da ogni incorporazione di triplofosfato deossiribonucleoside durante la sintesi del filamento di DNA, il sistema trasferisce i segnali chimici (pH change) catturati dagli elementi semiconduttori ai dati digitali diretti , che vengono ulteriormente interpretati nelle informazioni sulla sequenza del DNA. Eliminando la necessità di costosi rilevamenti ottici e reazioni di sequenziamento complesse, questa semplice chimica di sequenziamento riduce il costo totale del reagente e riduce il tempo di esecuzione del sequenziamento in 2 o 4 ore16. Ancora più importante, in base alle specifiche delle prestazioni del produttore, la piattaforma di sequenziamento dei semiconduttori può generare fino a 15 GB di dati di sequenziamento (dipende dalla qualità della libreria) per corsa, che è significativamente superiore rispetto ad alcuni degli altri sequencer producendo solo circa 3-4 GB di dati (con 2 x 75 bp di lunghezza di lettura)17. Nelle applicazioni cliniche di PGT-A, questa piattaforma può ottenere 24 campioni per chip generando fino a 80 milioni di letture17 e almeno un milione di letture univoche di ogni campione. La profondità di lettura può garantire che ogni campione abbia una copertura dell’intero genoma di 0,05x. I vantaggi di cui sopra di questa piattaforma lo rendono un metodo di screening ideale e quindi, facilitare le sue ampie applicazioni in PGT-A18.
Protocol
Representative Results
Discussion
Diverso da altre chimiche di sequenziamento, il sequencer qui descritto usa il semiconduttore per il rilevamento dei nucleotidi. Il chip stesso è un dispositivo elettronico che rileva gli ionidi idrogeno mediante l’incorporazione di base 17, basata sulla polimerasi, che consente il tempo di sequenziamento di 2,4 h del programma Proton. Inoltre, il chip è un chip di microwell che permette la localizzazione di una molecola bersaglio, che è diversa dalla chimica di sequenziamento delle celle di fl…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo studio è stato sostenuto dal Fondo generale di ricerca (Ref n. 14162417) di Hong Kong, dalla National Natural Science Foundation of China (Ref. n. 81860272), il principale piano di ricerca della Provincial Science and Technology Foundation of Guangxi (Ref No. AB16380219) e il China Postdoctoral Science Foundation Grant (Ref. 2018M630993) dalla Cina.
Materials
| PCR tubes, 0.2 mL | Axygen | PCR-02D-C | |
| UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0 | ThermoFisher | 15575020 | |
| PBS, pH 7.4, Ca2+ and Mg2+ free | ThermoFisher | 10010023 | |
| 1.0 M NaOH (1.0N) solution | SIGMA-ALDRICH | S2567 | For Melt-off solution. Molecular grade |
| Eppendorf LoBind Tubes, 1.5 mL | Fisher Scientific | 13-698-791 | |
| Ion Plus Fragment Library Kit | ThermoFisher | 4471252 | |
| ELGA PURELAB Flex 3 Water Purification System or Equivalent 18 MΩ water system |
ThermoFisher | 4474524 | |
| Ion Plus Fragment Library Kit | ThermoFisher | 4471252 | |
| PicoPLEX WGA Amplification buffer | Rubicon Genomics | R30050 | This can be replaced by SurePlex DNA Amplification System,catalog number: PR-40-415101-03. |
| PicoPLEX WGA Amplification enzyme | Rubicon Genomics | R30050 | This can be replaced by SurePlex DNA Amplification System,catalog number: PR-40-415101-03. |
| Ion OneTouch Amplification Plate | In kit: Ion OneTouch 2 Supplies (Part No. A26367). Extended kit component in Sheet 5 | ||
| Ion PI Annealing Buffer | |||
| MyOne Beads Capture Solution | |||
| Agilent 2100 Bioanalyzer instrument | Agilent | G2939AA | |
| Ion OneTouch Breaking Solution (black cap) | In kit: Ion PI Hi‑Q OT2 Solutions 200 (Part No. A26429). Extended kit component in Sheet 5 | ||
| Dynabeads MyOne Streptavidin C1 | ThermoFisher | 65001 | |
| PicoPLEX WGA Cell extraction buffer | Rubicon Genomics | R30050 | This can be replaced by SurePlex DNA Amplification System,catalog number: PR-40-415101-00. |
| PicoPLEX WGA Cell extraction enzyme | Rubicon Genomics | R30050 | This can be replaced by SurePlex DNA Amplification System,catalog number: PR-40-415101-03. |
| Ion PI Chip Kit v3 | ThermoFisher | A26771 | |
| Ion Chip Minifuge, 230 V | ThermoFisher | 4479673 | |
| Ion PI dATP | ThermoFisher | A26772 | |
| Ion PI dCTP | ThermoFisher | A26772 | |
| Ion PI dGTP | ThermoFisher | A26772 | |
| Ion Plus Fragment Library Kit | ThermoFisher | 4471252 | |
| Ion Plus Fragment Library Kit | ThermoFisher | 4471252 | |
| ThermoQ–Temperature Dry Bath | TAMAR | HB-T2-A | |
| NEBNext dsDNA Fragmentase | New England Biolabs | M0348L | |
| NEBNext dsDNA Fragmentase | New England Biolabs | M0348L | |
| Ion PI dTTP | ThermoFisher | A26772 | |
| Ion OneTouch 2 Instrument | ThermoFisher | INS1005527 | ThermoFisher Catalog number: 4474778. |
| Ion Plus Fragment Library Kit | ThermoFisher | 4471252 | |
| Ion One Touch ES | ThermoFisher | 8441-22 | ThermoFisher Catalog number: 4469495. Extended kit component in Sheet 5 |
| Ethanol | SIGMA-ALDRICH | 51976 | This can be replaced by any brand's molecular grade absolute ethanol. |
| PicoPLEX WGA Extraction enzyme dilution buffer | Rubicon Genomics | R30050 | This can be replaced by SurePlex DNA Amplification System,catalog number: PR-40-415101-01. |
| PicoPLEX WGA Extraction enzyme dilution buffer | Rubicon Genomics | R30050 | This can be replaced by SurePlex DNA Amplification System,catalog number: PR-40-415101-02. |
| Qubit 3.0 Fluorometer | ThermoFisher | Q33216 | This model has been replaced by Qubit 4 Fluorometer, Catalog number: Q33226. |
| Qubit ds DNA HS Assay kit | ThermoFisher | M2002-02 | |
| Qubit Assay Tubes | ThermoFisher | Q32856 | |
| Ion PI Foaming Solution | ThermoFisher | A26772 | |
| Index for barcoding of libraries | BaseCare | this is a in-house prepared index. Users can buy commercial product from ThermoFisher Ion Xpress Barcode Adapters Kits (Cat. No. 4474517) | |
| Ion PI Loading Buffer | ThermoFisher | A26772 | |
| Solid(TM) Buffer Kit-1X Low TE Buffer | ThermoFisher | 4389764 | |
| Agencour AMPure XP Kit | Beckman Coulter | A63880 | |
| DynaMag-2 magnet (magnetic rack) | ThermoFisher | 12321D | |
| Ion PI Master Mix PCR buffer | |||
| Sorvall Legend Micro 17 Microcentrifuge | Micro 17 | 75002430 | |
| Ion Plus Fragment Library Kit | ThermoFisher | 4471252 | |
| Nuclease-free water | ThermoFisher | AM9922 | This can be replaced by other brand. |
| PicoPLEX WGA Nuclease-free water | Rubicon Genomics | R30050 | This can be replaced by SurePlex DNA Amplification System,catalog number: PR-40-415101-03. |
| Ion OneTouch Oil bottle | Ion PI Hi‑Q OT2 Solutions 200 (Part No. A26429). Extended kit component in Sheet 5 | ||
| Ion Plus Fragment Library Kit | ThermoFisher | 4471252 | Extended kit component in Sheet 3 |
| double-strand DNA standard | This is a in-house prepared DNA standard for calibration of Qubit before quantification of library. | ||
| PicoPLEX WGA Preamplification buffer | Rubicon Genomics | R30050 | This can be replaced by SurePlex DNA Amplification System,catalog number: PR-40-415101-03. |
| PicoPLEX WGA Preamplification enzyme | Rubicon Genomics | R30050 | This can be replaced by SurePlex DNA Amplification System,catalog number: PR-40-415101-03. |
| Library Amplification Primer Mix | ThermoFisher | 4471252 | Extended kit component in Sheet 3 |
| Ion OneTouch Reaction Filter | Extended kit component in Sheet 5 | ||
| Recovery Router | Extended kit component in Sheet 5 | ||
| Recovery Tubes | Extended kit component in Sheet 5 | ||
| ISP Resuspension Solution | |||
| Ion Proton | ThermoFisher | DA8600 | This model is imported by Da An Gene Co.,LTD. of Sun Yat-Sen University from ThermoFisher and has been certified by China Food and Drug Administration for clinical application. The catalog number in ThermoFisher is 4476610. |
| Ion PI Hi‑Q Sequencing Polymerase | ThermoFisher | A26772 | |
| Ion PI Sequencing Primer | |||
| server for sequencer | Lenovo | T260 | |
| Ion PI Sphere Particles | |||
| Platinum PCR SuperMix High Fidelity | ThermoFisher | 4471252 | |
| Nalgene 25mm Syringe Filters | ThermoFisher | 724-2045 | Pore size: 0.45μm. Specifically for aqueous fluids. |
| Ion PI Hi‑Q W2 Solution | ThermoFisher | A26772 | |
| Ion PI 1X W3 Solution | ThermoFisher | A26772 | |
| Ion OneTouch Wash Solution C1 | |||
| The Ion PGM Hi‑Q View Sequencing Kit | ThermoFisher | A30044 | Extended kit component in Sheet 2 |
| Ion Plus Fragment Library Kit | ThermoFisher | 4471252 | Extended kit component in Sheet 3 |
| Ion PI Hi-Q Sequencing 200 Kit (1 sequencing run per initialization) | ThermoFisher | A26772 | Extended kit component in Sheet 4 |
| Ion PI Hi‑Q OT2 200 Kit | ThermoFisher | A26434 | Extended kit component in Sheet 5 |
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