利用成熟的细胞隔离试剂盒快速分离脂滴器
Summary
该方案建立了一种新的方法, 从小鼠肝脏脂滴分离和纯化, 使用一个完善的内质网隔离试剂盒。
Abstract
脂质液滴 (Ld) 是在最真核细胞和一些原核细胞的细胞溶胶中发现的生物活性细胞器。Ld 由中性脂质组成, 由磷脂和蛋白质的单层包裹。肝 ld 脂 (如神经酰胺) 和蛋白质与导致肝脂肪变性的几种疾病有关。尽管以前已经建立了 LD 隔离的方法, 但它们需要耗时的试剂制备, 而不是为隔离多个亚细胞隔间而设计的。我们试图建立一个新的协议, 以便能够从一个小鼠肝脏分离 ld, 内质网 (ER) 和溶酶体。
此外, 此处介绍的协议中使用的所有试剂都可在商业上获得, 并且在不牺牲 LD 纯度的情况下需要最少的试剂制备。在这里, 我们提出的数据, 比较这个新的协议作为一个标准的蔗糖梯度协议, 证明了相当的纯度, 形态和产量。此外, 我们可以使用相同的样本分离 ER 和溶酶体, 提供详细的洞察脂质及其相关蛋白质的形成和细胞内通量。
Introduction
Ld 是大多数真核细胞和一些原核细胞 1, 2,3的细胞溶胶中发现的生物活性细胞器.LD 核心由中性脂质 (如甘油三酯 (TG) 和胆固醇酯组成。它们还含有神经酰胺, 参与细胞信号转导途径4,5的生物活性脂质。Ld 被磷脂单层包围, 并涂有蛋白质, 包括环素蛋白环素 2 (plin2) 和 3 (plin3)1,5, 6.此外, 还存在与几种肝性脂肪病有关的脂原酶、脂肪酶和膜贩运蛋白, 包括非酒精性脂肪肝疾病、酒精性肝病和丙型肝炎3-5 ,6,7,8,9, 10.
Ld 被认为是由 ER 的外膜形成的, 含有新合成的 TG, 来自 er 衍生的游离脂肪酸11。然而, 目前尚不清楚汇集的脂质是否芽, 保持连接, 或从 ER6,11被切除, 使 ld 从 er 摆脱技术上具有挑战性。通过表面脂肪酶的作用, 游离脂肪酸可以从 Ld 中释放, 从而提供能源生产或膜合成。此外, Ld 可以通过脂质体作为调节机制降解, 并产生游离脂肪酸12。
除了 ER 和溶酶体, 还有其他细胞器–如线粒体、内生体、过氧化物酶体和质膜–在 LDs11的紧密关联中发现。这种严格的一夫多妻制使得它很难执行一个纯粹的 LD 提取。然而, 中性脂的先天低密度可以通过离心5加以利用.
传统上, ld 是使用蔗糖密度梯度1,5,13隔离的。然而, 这些方法并没有被设计用来分离其他细胞器。此外, 它们还需要耗时的试剂制备。该协议调整了商业上可用的 ER 隔离套件 (请参阅材料表), 以允许 ld 隔离。我们使用套件提供的提取缓冲区, 添加 ld 隔离步骤。此外, 该协议还可用于使用相同样本的 ER 和溶酶体隔离, 从而更全面地了解 Ld 的生命周期。为了验证这一新方法, 我们对 LD 的收率、形态、大小和纯度进行了分析。我们将这里给出的结果与使用蔗糖梯度进行 LD 隔离的广泛使用的协议的结果进行了比较。
我们使用了一个10至12周的, 20 克女性 c57bl6 老鼠禁食16小时 (食物清除在下午5:00 上午 9:00 ld 隔离时间), 可以免费获得水。TG 的典型产率为 0.6 mgg 肝脏, ld 蛋白的典型产率为 0.25 mg g。这为 sds page 为 ~ 10个免疫细胞提供了足够的材料。下面的协议详细介绍了所使用的试剂和适用于单个1克肝脏的协议。蔗糖梯度隔离协议适用于佐藤14号和吴15.
Protocol
Representative Results
Discussion
肝 LD 生物学正日益被认为是健康和疾病中肝细胞生理学的关键调节剂。作为真正的细胞器, Ld 是动态的, 与其他细胞结构相互作用, 并包含在它们里面的生物活性成分参与脂质和葡萄糖的稳态。蔗糖梯度通常用于 LD 隔离, 使研究人员能够研究 LD 结构, 但它要求他们制造大量的缓冲。我们已经证明, 使用商用 ER 隔离套件是另一种工具, 不仅可用于 LD 隔离, 还可用于 ER 和溶酶体的串联隔离, 从而能够更?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们感谢阿布兰森家族癌症研究所。这项工作得到以下赠款的支持: NIH/NIAAA R01 AA026302-01、NIH/NIAA K08-AA021424、Robert Wood johnson 基金会、harold Amos 医学院发展奖、7158, IDOM IRC 试点奖 P30 DK019525 (r. m. c.);NIHPAAA F32-AA024347 (J. C.)。这项工作得到了 NIH P30-DK050306 及其核心设施 (分子病理学和成像核心、分子生物学表达核和细胞培养核心) 及其试点赠款方案的部分支持。内容完全由作者负责, 不一定代表国家卫生研究院的官方观点。
Materials
| BioExpress Vortex Mixer | GeneMate | S-3200-1 | Vortex Mixer |
| Centrifuge 54242 R | Eppendorf | 54242 R | Refrigerated Counter Microcentrifuge Rotor: FA-45-24-11 |
| Centrifuge Sorvall RC6 + | Thermo Scientific | RC6+ | Refrigerated High Speed Centrifuge Rotor: F21S-8x50y |
| Centrifuge Sorvall Legend RT+ | Thermo Scientific | Legend RT+ | Refrigerated High Capacity Centrifuge Rotor: 75006445 Bucket: 75006441 |
| cOmplete Protease Inhibitor Cocktail | Sigma Aldrich | 04 693 116 001 | Protease Inhibitor Tablets |
| Diagenode Bioruptur UCD-200 | Diagenode | UCD-200 | Sonication System |
| Dounce Tissue Grinder (45 mL) | Wheaton | 357546 | Use Loose pestle |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (1x) | Corning | 21-031-CM | |
| Endoplasmic Reticulum Isolation Kit | Sigma Aldrich | ER0100 | For ER kit Extraction: Contains: Isotonic Extraction Buffer 5X 100 mL Hypotonic Extraction Buffer 10 mL Calcium chloride, 2.5 M solution 5 mL OptiPrep Density Gradient Medium 100 mL Blunt Nosed Needle 1 ea. |
| External light source for flourescent excitation | Leica | Leica EL6000 | |
| Hydrochloric acid | Sigma Aldrich | H1758 | Hydrochloric Acid |
| ImageJ | Image Analysis Software | ||
| Inverted Modulating Contrast Microscope | Leica | Leica DM IRB | |
| Lysosome Enrichment Kit for Tissues and Cultured Cells | Thermo Fisher Scientific | 89839 | For Lysosome Isolation |
| Microscope Camera | Qimaging | QICAM fast 1394 | |
| Optima XL-100K Ultracentrifuge | Beckman-Coulter | XL-100K | Ultracentrifuge Rotor: SW41Ti |
| Pasteur Pipettes | Fisher Scientific | 22-042817 | |
| Petri Dish 5 cm | Fisher Scientific | FB0875713A | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 23225 | |
| PhosSTOP | Sigma Aldrich | 04 906 845 001 | Phosphatase Inhibior Tablets |
| Sterile Surgical Blade #10 | Pioneer | S2646 | |
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-500 | Crystalline/Certified ACS |
| Triglyceride Liquicolor Kit | Stanbio | 2200-225 | Colorimetric Triglyceride kit |
| Tris Base | Fisher Scientific | BP152-1 | For TE buffer |
| Triton X-100 | Fisher BioReagents | BP151-100 | 5%, Polyethylene glycol p-(1,1,3,3-tetramethylbutyl)-phenyl ether, Protein Lysis Reagent |
| UltraPure EDTA (0.5M, pH 8.0) | Thermo Fisher Scientific | 15575-038 | For TE buffer |
References
- Brasaemle, D. L., Wolins, N. E. Isolation of Lipid Droplets from Cells by Density Gradient Centrifugation. Current Protocols in Cell Biology. 72, (2016).
- Ding, Y., et al. Isolating lipid droplets from multiple species. Nature Protocols. 8 (1), 43-51 (2013).
- Gao, Q., Goodman, J. M. The lipid droplet-a well-connected organelle. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 3, 49 (2015).
- Correnti, J. M., et al. Ethanol and C2 ceramide activate fatty acid oxidation in human hepatoma cells. Scientific Reports. 8 (1), 12923 (2018).
- Williams, B., et al. A novel role for ceramide synthase 6 in mouse and human alcoholic steatosis. FASEB Journal. 32 (1), 130-142 (2018).
- Carr, R. M., Ahima, R. S. Pathophysiology of lipid droplet proteins in liver diseases. Experimental Cell Research. 340 (2), 187-192 (2016).
- Carr, R. M., et al. Perilipin Staining Distinguishes Between Steatosis and Nonalcoholic. Steatohepatitis in Adults and Children. Clinical Gastroenterology and Hepatology. 15 (1), 145-147 (2017).
- Carr, R. M., et al. Reduction of TIP47 improves hepatic steatosis and glucose homeostasis in mice. American Journal of Physiology: Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 302 (8), R996-R1003 (2012).
- Carr, R. M., Peralta, G., Yin, X., Ahima, R. S. Absence of perilipin 2 prevents hepatic steatosis, glucose intolerance and ceramide accumulation in alcohol-fed mice. PLoS One. 9 (5), e97118 (2014).
- Tsai, T. H., et al. The constitutive lipid droplet protein PLIN2 regulates autophagy in liver. Autophagy. 13 (7), 1130-1144 (2017).
- Guo, Y., Cordes, K. R., Farese, R. V., Walther, T. C. Lipid droplets at a glance. Journal of Cell Science. 122 (Pt 6), 749-752 (2009).
- Liu, K., Czaja, M. J. Regulation of lipid stores and metabolism by lipophagy. Cell Death and Differentiation. 20 (1), 3-11 (2013).
- Mannik, J., Meyers, A., Dalhaimer, P. Isolation of cellular lipid droplets: two purification techniques starting from yeast cells and human placentas. Journal of Visualized Experiments. (86), e509814 (2014).
- Sato, S., et al. Proteomic profiling of lipid droplet proteins in hepatoma cell lines expressing hepatitis C virus core protein. Journal of Biochemistry. 139 (5), 921-930 (2006).
- Wu, C. C., Howell, K. E., Neville, M. C., Yates, J. R., McManaman, J. L. Proteomics reveal a link between the endoplasmic reticulum and lipid secretory mechanisms in mammary epithelial cells. Electrophoresis. 21 (16), 3470-3482 (2000).
- Zhang, S., et al. Morphologically and Functionally Distinct Lipid Droplet Subpopulations. Scientific Reports. 6, 29539 (2016).
