एक अच्छी तरह से स्थापित Organelle अलगाव किट का उपयोग रैपिड लिपिड छोटी बूंद आइसोलेशन प्रोटोकॉल
Summary
इस प्रोटोकॉल एक अच्छी तरह से स्थापित एंडोप्लाज्मिक जालिका आइसोलेशन किट का उपयोग कर, माउस livers से लिपिड छोटी बूंद अलगाव और शुद्धि की एक नवीन विधि स्थापित करता है ।
Abstract
लिपिड बूंदों (LDs) बायोएक्टिव organelles सबसे यूकैरियोटिक और कुछ प्रोकैरियोटिक कोशिकाओं के cytosol के भीतर पाए जाते हैं । LDs फॉस्फोलिपिड और प्रोटीन के एक monolayer द्वारा encased तटस्थ लिपिड से बना रहे हैं । यकृत LD lipids, जैसे चीनी मिट्टी की चीज़ें, और प्रोटीन कई रोगों है कि यकृत steatosis कारण में फंसाया जाता है । हालांकि पिछले तरीकों LD अलगाव के लिए स्थापित किया गया है, वे एक समय लेने की आवश्यकता होती है अभिकर्मकों की तैयारी और एकाधिक subcellular डिब्बों के अलगाव के लिए तैयार नहीं हैं । हम एक नया प्रोटोकॉल स्थापित करने के लिए एक एकल माउस जिगर से LDs, अंतर्द्रव्यी जालिका (ईआर), और lysosomes के अलगाव को सक्षम करने की मांग की ।
इसके अलावा, यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल में इस्तेमाल सभी अभिकर्मकों व्यावसायिक रूप से उपलब्ध है और LD शुद्धता त्याग के बिना ंयूनतम अभिकर्मक तैयारी की आवश्यकता है । यहां हम एक मानक सुक्रोज ढाल प्रोटोकॉल के लिए इस नए प्रोटोकॉल की तुलना डेटा प्रस्तुत करते हैं, तुलनीय शुद्धता, आकारिकी का प्रदर्शन, और उपज । इसके अतिरिक्त, हम एक ही नमूने का उपयोग कर और lysosomes ईआर को अलग कर सकते हैं, और लिपिड और उनके जुड़े प्रोटीन के गठन और intracellular प्रवाह में विस्तृत जानकारी प्रदान ।
Introduction
LDs बायोएक्टिव organelles सबसे यूकैरियोटिक कोशिकाओं के cytosol में पाया जाता है और कुछ प्रोकेरियोटिक कोशिकाओं1,2,3। एलडी कोर तटस्थ लिपिड जैसे ट्राइग्लिसराइड (टीजी) और कोलेस्ट्रॉल esters से बना है । वे भी सिरेमिक, बायोएक्टिव लिपिड सेलुलर संकेत रास्ते4,5में शामिल होते हैं । LDs एक फॉस्फोलिपिड monolayer से घिरा हुआ है और प्रोटीन के साथ लेपित, perilipin प्रोटीन perilipin 2 (PLIN2) और 3 (PLIN3)1,5,6सहित । इसके अलावा मौजूद lipogenic एंजाइमों, lipases, और झिल्ली तस्करी प्रोटीन है कि कई यकृत steatotic रोगों से जोड़ा गया है, nonalcoholic फैटी लीवर रोग सहित, शराबी जिगर की बीमारी, और हेपेटाइटिस सी3,5 ,6,7,8,9,10।
LDs एर की बाहरी झिल्ली से फार्म करने के लिए लगा रहे हैं और नए संश्लेषित टीजी शामिल एर से sourced मुक्त फैटी एसिड11. हालांकि, यह अज्ञात है कि क्या पूल्ड लिपिड बड, जुड़े रहते हैं, या एर6,11से excised कर रहे हैं, एर से मुक्त LDs के अलगाव को तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण बना । नि: शुल्क फैटी एसिड के लिए ऊर्जा उत्पादन या झिल्ली संश्लेषण के लिए प्रदान करने के लिए सतह lipases की कार्रवाई से LDs से मुक्त किया जा सकता है । इसके अतिरिक्त, LDs एक नियामक तंत्र के रूप में lipophagy के माध्यम से अपमानित किया जा सकता है और मुक्त फैटी एसिड का उत्पादन12।
इसके अलावा, अन्य अंगकों-जैसे माइटोकॉन्ड्रिया, एंडोसोम्स, पेरोऑक्सिज्म और प्लाज्मा झिल्ली-जो LDs11के निकट सहयोग के भीतर पाए जाते हैं । यह तंग बहुविवाह एक शुद्ध LD निष्कर्षण करने के लिए मुश्किल बना देता है । हालांकि, तटस्थ ‘ lipids जंमजात कम घनत्व के माध्यम से अपकेंद्रण5का लाभ लिया जा सकता है ।
परंपरागत रूप से, LDs एक सुक्रोज घनत्व ढाल1,5,13का उपयोग कर अलग कर दिया गया है । हालांकि, इन पद्धतियों अंय organelles को अलग करने के लिए डिज़ाइन नहीं किया गया है । इसके अतिरिक्त, वे reagents के समय लेने वाली तैयारी की आवश्यकता है । इस प्रोटोकॉल एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध ईआर आइसोलेशन किट adapts ( सामग्री की तालिकादेखें) LD अलगाव के लिए अनुमति देने के लिए. हम निष्कर्षण किट द्वारा प्रदान बफर, एक LD अलगाव कदम जोड़ने का उपयोग करें । इसके अलावा, प्रोटोकॉल भी एर और लाइसोसोमल एक ही नमूने का उपयोग अलगाव के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, LDs के जीवन चक्र के एक अधिक व्यापक छवि के लिए अनुमति दी । इस नई विधि को मांय करने के लिए, हम LD उपज, morphology, आकार, और शुद्धता परख । हम यहां प्रस्तुत परिणामों की तुलना एक व्यापक रूप से इस्तेमाल किया प्रोटोकॉल LD अलगाव के लिए एक सुक्रोज ढाल का उपयोग के साथ प्राप्त किया ।
हम एक 10-12-सप्ताह पुराने, 20 ग्राम महिला C57BL/6 माउस के लिए ५.०० बजे (भोजन को हटाने के लिए एक ९.०० A.M. के लिए पानी का उपयोग करने के साथ LD अलगाव समय) । टीजी के लिए ठेठ उपज ०.६ मिलीग्राम/जी जिगर है, और LD प्रोटीन के लिए, यह ०.२५ मिलीग्राम/ इस SDS पृष्ठ द्वारा ~ 10 immunoblots के लिए पर्याप्त सामग्री प्रदान करता है । नीचे प्रोटोकॉल का उपयोग किया अभिकर्मक और एक प्रोटोकॉल एक एकल 1 जी जिगर के लिए उपयुक्त है । सुक्रोज ढाल अलगाव प्रोटोकॉल सातो14 और वू15से अनुकूलित है ।
Protocol
Representative Results
Discussion
यकृत LD जीवविज्ञान तेजी से दोनों स्वास्थ्य और रोग में hepatocellular शरीर क्रिया विज्ञान के एक महत्वपूर्ण नियामक के रूप में मांयता प्राप्त किया जा रहा है । सदाशयी organelles के रूप में, LDs गतिशील हैं, अंय सेलुलर संरचनाओं …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम अब्रामसन फैमिली कैंसर रिसर्च इंस्टीट्यूट का शुक्रिया अदा करते हैं । यह काम निम्नलिखित अनुदान द्वारा समर्थित है: NIH/निएएए R01 AA026302-01, NIH/निएएए K08-AA021424, रॉबर्ट वुड जॉनसन फाउंडेशन, हेरोल्ड अमोस चिकित्सा संकाय विकास पुरस्कार, ७१५८, IDOM DRC पायलट पुरस्कार P30 DK019525 (R.M.C.); NIH/निएएए F32-AA024347 (जेसी) । इस काम के हिस्से में NIH P30-DK050306 और उसके प्रमुख सुविधाओं (आणविक पैथोलॉजी और इमेजिंग कोर, आणविक जीवविज्ञान/जीन अभिव्यक्ति कोर, और सेल संस्कृति कोर) और इसके पायलट अनुदान कार्यक्रम द्वारा समर्थित था । सामग्री केवल लेखकों की जिंमेदारी है और जरूरी स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों के सरकारी विचारों का प्रतिनिधित्व नहीं करता है ।
Materials
| BioExpress Vortex Mixer | GeneMate | S-3200-1 | Vortex Mixer |
| Centrifuge 54242 R | Eppendorf | 54242 R | Refrigerated Counter Microcentrifuge Rotor: FA-45-24-11 |
| Centrifuge Sorvall RC6 + | Thermo Scientific | RC6+ | Refrigerated High Speed Centrifuge Rotor: F21S-8x50y |
| Centrifuge Sorvall Legend RT+ | Thermo Scientific | Legend RT+ | Refrigerated High Capacity Centrifuge Rotor: 75006445 Bucket: 75006441 |
| cOmplete Protease Inhibitor Cocktail | Sigma Aldrich | 04 693 116 001 | Protease Inhibitor Tablets |
| Diagenode Bioruptur UCD-200 | Diagenode | UCD-200 | Sonication System |
| Dounce Tissue Grinder (45 mL) | Wheaton | 357546 | Use Loose pestle |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (1x) | Corning | 21-031-CM | |
| Endoplasmic Reticulum Isolation Kit | Sigma Aldrich | ER0100 | For ER kit Extraction: Contains: Isotonic Extraction Buffer 5X 100 mL Hypotonic Extraction Buffer 10 mL Calcium chloride, 2.5 M solution 5 mL OptiPrep Density Gradient Medium 100 mL Blunt Nosed Needle 1 ea. |
| External light source for flourescent excitation | Leica | Leica EL6000 | |
| Hydrochloric acid | Sigma Aldrich | H1758 | Hydrochloric Acid |
| ImageJ | Image Analysis Software | ||
| Inverted Modulating Contrast Microscope | Leica | Leica DM IRB | |
| Lysosome Enrichment Kit for Tissues and Cultured Cells | Thermo Fisher Scientific | 89839 | For Lysosome Isolation |
| Microscope Camera | Qimaging | QICAM fast 1394 | |
| Optima XL-100K Ultracentrifuge | Beckman-Coulter | XL-100K | Ultracentrifuge Rotor: SW41Ti |
| Pasteur Pipettes | Fisher Scientific | 22-042817 | |
| Petri Dish 5 cm | Fisher Scientific | FB0875713A | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 23225 | |
| PhosSTOP | Sigma Aldrich | 04 906 845 001 | Phosphatase Inhibior Tablets |
| Sterile Surgical Blade #10 | Pioneer | S2646 | |
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-500 | Crystalline/Certified ACS |
| Triglyceride Liquicolor Kit | Stanbio | 2200-225 | Colorimetric Triglyceride kit |
| Tris Base | Fisher Scientific | BP152-1 | For TE buffer |
| Triton X-100 | Fisher BioReagents | BP151-100 | 5%, Polyethylene glycol p-(1,1,3,3-tetramethylbutyl)-phenyl ether, Protein Lysis Reagent |
| UltraPure EDTA (0.5M, pH 8.0) | Thermo Fisher Scientific | 15575-038 | For TE buffer |
References
- Brasaemle, D. L., Wolins, N. E. Isolation of Lipid Droplets from Cells by Density Gradient Centrifugation. Current Protocols in Cell Biology. 72, (2016).
- Ding, Y., et al. Isolating lipid droplets from multiple species. Nature Protocols. 8 (1), 43-51 (2013).
- Gao, Q., Goodman, J. M. The lipid droplet-a well-connected organelle. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 3, 49 (2015).
- Correnti, J. M., et al. Ethanol and C2 ceramide activate fatty acid oxidation in human hepatoma cells. Scientific Reports. 8 (1), 12923 (2018).
- Williams, B., et al. A novel role for ceramide synthase 6 in mouse and human alcoholic steatosis. FASEB Journal. 32 (1), 130-142 (2018).
- Carr, R. M., Ahima, R. S. Pathophysiology of lipid droplet proteins in liver diseases. Experimental Cell Research. 340 (2), 187-192 (2016).
- Carr, R. M., et al. Perilipin Staining Distinguishes Between Steatosis and Nonalcoholic. Steatohepatitis in Adults and Children. Clinical Gastroenterology and Hepatology. 15 (1), 145-147 (2017).
- Carr, R. M., et al. Reduction of TIP47 improves hepatic steatosis and glucose homeostasis in mice. American Journal of Physiology: Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 302 (8), R996-R1003 (2012).
- Carr, R. M., Peralta, G., Yin, X., Ahima, R. S. Absence of perilipin 2 prevents hepatic steatosis, glucose intolerance and ceramide accumulation in alcohol-fed mice. PLoS One. 9 (5), e97118 (2014).
- Tsai, T. H., et al. The constitutive lipid droplet protein PLIN2 regulates autophagy in liver. Autophagy. 13 (7), 1130-1144 (2017).
- Guo, Y., Cordes, K. R., Farese, R. V., Walther, T. C. Lipid droplets at a glance. Journal of Cell Science. 122 (Pt 6), 749-752 (2009).
- Liu, K., Czaja, M. J. Regulation of lipid stores and metabolism by lipophagy. Cell Death and Differentiation. 20 (1), 3-11 (2013).
- Mannik, J., Meyers, A., Dalhaimer, P. Isolation of cellular lipid droplets: two purification techniques starting from yeast cells and human placentas. Journal of Visualized Experiments. (86), e509814 (2014).
- Sato, S., et al. Proteomic profiling of lipid droplet proteins in hepatoma cell lines expressing hepatitis C virus core protein. Journal of Biochemistry. 139 (5), 921-930 (2006).
- Wu, C. C., Howell, K. E., Neville, M. C., Yates, J. R., McManaman, J. L. Proteomics reveal a link between the endoplasmic reticulum and lipid secretory mechanisms in mammary epithelial cells. Electrophoresis. 21 (16), 3470-3482 (2000).
- Zhang, S., et al. Morphologically and Functionally Distinct Lipid Droplet Subpopulations. Scientific Reports. 6, 29539 (2016).
