Rensning af den dendritiske Filopodia-rige fraktion
Summary
I denne protokol introducerer vi en metode til rensning af dendritiske filopodia-rige fraktion fra den fagocytiske Cup-lignende fremspringende struktur på dyrkede hippocampus neuroner ved at drage fordel af den specifikke og stærke affinitet mellem en dendritisk filopodial adhæsions molekyle, TLCN og et ekstracellulær matrix molekyle, vitronectin.
Abstract
Dendritiske filopodia er tynde og lange fremspring baseret på actin filament, og de udvider og trækker som om at søge efter et mål Axon. Når dendritiske filopodia etablerer kontakt med et mål Axon, begynder de at modnes i spines, hvilket fører til dannelsen af en synapse. Telencephalin (TLCN) er rigeligt lokaliseret i dendritiske filopodia og er gradvist udelukket fra spines. Overekspression af TLCN i dyrkede hippocampus neuroner inducerer dendritiske filopodia dannelse. Vi viste, at telencepin stærkt binder sig til en ekstracellulær matrix molekyle, vitronectin. Vitronectin-coatede mikroperler induceret Fagocytisk kop dannelse på neuronal dendritter. I fagocytic Cup akkumuleres tlcn-bindende proteiner såsom phosphoryleret Ezrin/Radixin/Moesin (phospho-ERM) og F-actin, hvilket tyder på, at komponenterne i det fagocytiske bæger ligner dem af dendritiske filopodia. Således udviklede vi en metode til rensning af den fagocytiske kop i stedet for dendritiske filopodia. Magnetiske polystyren perler blev belagt med vitronectin, som er rigeligt til stede i kulturen medium hippocampus neuroner og som inducerer Fagocytisk kop dannelse på neuronal dendritter. Efter 24 timers inkubation var de fagocytiske kopper mildt opløste med vaskemiddel og indsamlet ved hjælp af en magnet separator. Efter vask af perlerne blev de bindende proteiner elueret og analyseret ved sølvfarvning og vestlig blotting. I bindings brøken var TLCN og actin rigeligt til stede. Desuden blev mange proteiner identificeret fra fraktionen lokaliseret til dendritiske filopodia; således, vi navngiver bindende fraktion som dendritiske filopodia-rige fraktion. I denne artikel beskrives detaljer om rensningsmetoden for den dendritiske filopodia-rige fraktion.
Introduction
Dendritiske filopodia menes at være forløbere for spines. Actin filamenter i dendritiske filopodia regulerer deres forlængelse og tilbagetrækning1,2,3. Efter kontakt med en Axon begynder udvalgte dendritiske filopodia deres modning i spines, og en synapse dannes4,5. Komponenterne i Spiner er blevet fastlagt ud fra omfattende analyse af postsynaptiske massefylde fraktioner6,7, mens komponenterne i dendritiske filopodia er stort set ukendte. Det har vist sig, at telencepin (tlcn), ERM, syngap, RAS, PI3 kinase, akt, MTOR, Polo-like kinase 2, camkii, syndecan-2, paralemin-1, ARF6 og ephb regulerer dendritiske filopodia dannelse5,8,9 ,10,11, mens en metode ikke er blevet udviklet til den omfattende analyse af molekyler, der findes i dendritiske filopodia.
TLCN (ICAM-5) udtrykkes specifikt af spiny neuroner i det mest rostrale hjerne segment, telencephalon12. Tlcn har 9 IG-lignende domæner i sin ekstracellulære region, en transmembran region, og en cytoplasmisk hale13. Tlcn binder sig til vitronectin (vn) og LFA-1 anti i dets ekstracellulære region, til presenilin i dets transmembran-region, og til phospho-ERM og α-actinin i dets cytoplasmiske region5,8,14,15 ,16. Tlcn binder sig til det cytoskelet actin gennem fosho-ERM ved spidserne af dendritiske filopodia og α-actinin i spines og dendritiske aksler8,16.
Vi viste, at overekspression af TLCN forbedret dendritiske filopodia dannelse og induceret omversion af spines til filopodia10. Den konstitutive aktive form af PMS bundet til tlcn cytoplasmiske region og forbedret dendritiske filopodia dannelse8. Således regulerer TLCN dendritiske filopodia dannelse gennem actin bindende proteiner. Esselens et al. påviste, at mikroperler inducerede TLCN-akkumulering på dyrkede neuroner17. Vi viste, at fagocytiske Cup strukturer blev dannet på neuronal dendritter omkring VN-belagte mikroperler i en TLCN-afhængige måde15. Bestanddele af dendritiske filopodia svarer til de fagocytiske bæger. Det er svært at indsamle dendritiske filopodia, men det er relativt lettere at indsamle den fagocytiske kop ved hjælp af magnetiske mikroperler. Således udviklede vi en metode til at rense den fagocytiske kop i stedet for dendritiske filopodia18. Her beskriver vi rensningsmetoden for den dendritiske filopodia-rige fraktion.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi udviklede en rensningsmetode for dendritiske filopodia-rige fraktion ved hjælp af affinitet mellem celle adhæsions molekyle TLCN og det ekstracellulære matrix protein vitronectin. Sammenlignet med PSD-fraktion kunne det være muligt at identificere de synaptiske proteiner, der optræder på den umodne synapse fra den dendritiske filopodia-rige fraktion. Bestanddelene i den dendritiske filopodia-rige fraktion adskiller sig således fra dem i PSD-fraktionen med 74%. Forskellig fra PSD fraktion, vi brugte dyrkede hipp…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Shigeo Okabe og Hitomi Matsuno for den lave-density kultur af hippocampus neuroner, Masayoshi Mishina for tlcn-mangelfulde mus, Sachiko Mitsui og Momoko shiozaki for teknisk assistance, og medlemmer af yoshihara laboratorium for nyttige diskussioner . Dette arbejde blev støttet af JSPS KAKENHI Grant NOS. JP20700307, JP22700354 og JP24500392 og MEXT KAKENHI Grant NOS. JP23123525 til YF og JP20022046, JP18H04683 og JP18H05146 til åå.
Materials
| 1 M HEPES | Gibco | 15630-080 | |
| 1.7 ml Low Binding MCT | Sorenson BioScience | 39640T | |
| 200 mM L-Glutamine | Gibco | 2530149 | |
| 35-mm plastic cell culture dishes | Corning | 430165 | |
| Anti-actin | Sigma-Aldrich | A-5060 | |
| Anti-alpha-Actinin | Sigma-Aldrich | A-5044 | |
| Anti-alpha-tubulin | Sigma-Aldrich | T-9026 | |
| Anti-Ezrin | Sigma-Aldrich | clone3C12, SAB4200806 | |
| Anti-Galphaq | Santacruz | sc-393 | |
| Anti-MAP2 | Chemicon | clone AP20, MAB3418 | |
| Anti-Moesin | Sigma-Aldrich | clone 38/87, M7060 | |
| Anti-PLCbeta1 | Santacuz | sc-5291 | |
| Anti-PSD95 | MA2 | ABR | |
| Anti-Spectrin beta | Chemicon | MAB1622 | |
| B27 | Gibco | 0080085SA | |
| BCA protein assay kit | Thermo | 23227 | |
| Bromophenol blue | Merck | 1.08122.0005 | |
| calcium chrolide, hydrous | Wako | 038-19735 | |
| Cell scraper | Falcon | 353085 | |
| Cell strainer | Falcon | 352350 | |
| Choline chloride | Sigma-Aldrich | C7527 | |
| Complete EDTA free protease inhibitor cocktail | Roche | 11873580001 | |
| Cytosine beta-D-arabinofuranoside | Sigma-Aldrich | C-6645 | |
| DNase-I | Sigma-Aldrich | DN-25 | |
| D-Pantothenic acid hemicalcium salt | Sigma-Aldrich | P5155 | |
| DynaMag-2 Magnet | Thermo | 12321D | |
| ECL Prime Western Blotting Detection Reagent | GE | RPN2232 | |
| e-PAGEL 5-20% SDS-PAGE gradient gel | ATTO | E-T520L | |
| Folic acid | Sigma-Aldrich | F8758 | |
| HBSS | Gibco | 14175095 | |
| HRP-conjugated anti-rabbit IgG | Jackson ImmunoResearch | 111-035-144 | |
| i-Inositol | Sigma-Aldrich | I7508 | |
| LAS-1000 mini | Fuji Film | LAS-1000 mini | For detection of luminescence from WB membrane |
| Magnetic polystyrene microbeads | Sperotech | PM-20-10 | |
| MEM amino acid solution | Gibco | 11130-051 | 30 mM L-Arginine hydrochloride, 5 mM L-Cystine, 10 mM L-Histidine hydrochloride-H2O, 20 mM L-Isoleucine, 20 mM L-Leucine, 19.8 mM L-Lysine hydrochloride, 5.1 mM L-Methionine, 10 mM L-Phenylalanine, 20 mM L-Threonine, 2.5 mM L-Tryptophan, 10 mM L-Tyrosine, and 20 mM L-Valine |
| Mini-slab size electrophoresis system | ATTO | AE-6530 | |
| Niacinamide | Sigma-Aldrich | N0636 | |
| Penicilin / Streptomycin | Gibco | 15070063 | |
| PhosSTOP phosphatase inhibitor cocktail | Roche | 4906845001 | |
| Poly-L-lysine hydrobromide | Nacali | 28360-14 | |
| Pyridoxal HCl | Sigma-Aldrich | P6155 | |
| Riboflavin | Sigma-Aldrich | R9504 | |
| Silver Stain 2 Kit wako | Wako | 291-5031 | |
| Thiamine HCl | Sigma-Aldrich | T1270 | |
| Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell | Bio-rad | 1703940JA | |
| Ultra pure water | MilliQ | For production of ultra pure water |
References
- Fiala, J. C., Feinberg, M., Popov, V., Harris, K. M. Synaptogenesis via dendritic filopodia in developing hippocampal area CA1. Journal of Neuroscience. 18 (21), 8900-8911 (1998).
- Portera-Cailliau, C., Pan, D. T., Yuste, R. Activity-regulated dynamic behavior of early dendritic protrusions: evidence for different types of dendritic filopodia. Journal of Neuroscience. 23 (18), 7129-7142 (2003).
- Ziv, N. E., Smith, S. J. Evidence for a role of dendritic filopodia in synaptogenesis and spine formation. Neuron. 17 (1), 91-102 (1996).
- Lohmann, C., Bonhoeffer, T. A role for local calcium signaling in rapid synaptic partner selection by dendritic filopodia. Neuron. 59 (2), 253-260 (2008).
- Yoshihara, Y., De Roo, M., Muller, D. Dendritic spine formation and stabilization. Current Opinion in Neurobiology. 19 (2), 146-153 (2009).
- Bayes, A., et al. Comparative study of human and mouse postsynaptic proteomes finds high compositional conservation and abundance differences for key synaptic proteins. PLoS One. 7 (10), e46683 (2012).
- Bayes, A., et al. Characterization of the proteome, diseases and evolution of the human postsynaptic density. Nature Neuroscience. 14 (1), 19-21 (2011).
- Furutani, Y., et al. Interaction between telencephalin and ERM family proteins mediates dendritic filopodia formation. Journal of Neuroscience. 27 (33), 8866-8876 (2007).
- Mao, Y. T., et al. Filopodia Conduct Target Selection in Cortical Neurons Using Differences in Signal Kinetics of a Single Kinase. Neuron. 98 (4), 767-782 (2018).
- Matsuno, H., et al. Telencephalin slows spine maturation. Journal of Neuroscience. 26 (6), 1776-1786 (2006).
- Raemaekers, T., et al. ARF6-mediated endosomal transport of Telencephalin affects dendritic filopodia-to-spine maturation. The EMBO Journal. 31 (15), 3252-3269 (2012).
- Mori, K., Fujita, S. C., Watanabe, Y., Obata, K., Hayaishi, O. Telencephalon-specific antigen identified by monoclonal antibody. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84 (11), 3921-3925 (1987).
- Yoshihara, Y., Mori, K. Telencephalin: a neuronal area code molecule?. Neuroscience Research. 21 (2), 119-124 (1994).
- Annaert, W. G., et al. Interaction with telencephalin and the amyloid precursor protein predicts a ring structure for presenilins. Neuron. 32 (4), 579-589 (2001).
- Furutani, Y., et al. Vitronectin induces phosphorylation of ezrin/radixin/moesin actin-binding proteins through binding to its novel neuronal receptor telencephalin. Journal of Biological Chemistry. 287 (46), 39041-39049 (2012).
- Nyman-Huttunen, H., Tian, L., Ning, L., Gahmberg, C. G. alpha-Actinin-dependent cytoskeletal anchorage is important for ICAM-5-mediated neuritic outgrowth. Journal of Cell Biology. 119 (Pt 15), 3057-3066 (2006).
- Esselens, C., et al. Presenilin 1 mediates the turnover of telencephalin in hippocampal neurons via an autophagic degradative pathway. Journal of Cell Biology. 166 (7), 1041-1054 (2004).
- Furutani, Y., Yoshihara, Y. Proteomic Analysis of Dendritic Filopodia-Rich Fraction Isolated by Telencephalin and Vitronectin Interaction. Frontiers in Synaptic Neuroscience. 10, 27 (2018).
- Lu, Z., Piechowicz, M., Qiu, S. A Simplified Method for Ultra-Low Density, Long-Term Primary Hippocampal Neuron Culture. Journal of Visualized Experiments. (109), (2016).
- Okabe, S., Miwa, A., Okado, H. Alternative splicing of the C-terminal domain regulates cell surface expression of the NMDA receptor NR1 subunit. The Journal of Neuroscience. 19 (18), 7781-7792 (1999).
- Okabe, S., Vicario-Abejon, C., Segal, M., McKay, R. D. Survival and synaptogenesis of hippocampal neurons without NMDA receptor function in culture. European Journal of Neuroscience. 10 (6), 2192-2198 (1998).
