Purificação da fração rica de Filopodia dendrítica
Summary
Neste protocolo, nós introduzimos um método para purificante a fração filopodia-rica dendríticas do fagocitária copo-como a estrutura do protrusão em neurônios hippocampal cultivados aproveitando-se da afinidade específica e forte entre um filopodial dendríticas molécula de adesão, TLCN, e uma molécula de matriz extracelular, vitronectina.
Abstract
Os filopódios dendríticos são protrusões finas e longas com base no filamento de actina, e eles se estendem e se retraem como se estivessem buscando um AXON alvo. Quando o filopódia dendrítico estabelecer contato com um AXON alvo, eles começam a amadurecer em espinhos, levando à formação de uma sinapse. A telencífica (tlcn) está abundantemente localizada em filopódia dendrítico e é gradualmente excluída de espinhas. O overexpression de tlcn em neurônios hippocampal cultivados induz a formação dendríticas do filopódia. Nós mostramos que o Telencephalin liga fortemente a uma molécula extracelular da matriz, Vitronectin. Microesferas Vitronectin-revestidos induziu a formação fagocitária do copo em dendrites neuronal. No copo fagocitítico, TLCN, proteínas de ligação TLCN tais como Ezrin fosforilado/Radixina/Moesina (fosho-ERM), e F-Actina são acumuladas, o que sugere que os componentes do copo fagocítico são semelhantes aos de filopodia dendrítico. Assim, desenvolvemos um método para purificação do copo fagocítico em vez de filopópodes dendrítico. Os grânulos magnéticos do poliestireno foram revestidos com o Vitronectin, que é abundantemente atual no meio de cultura de neurônios hippocampal e que induz a formação fagocitária do copo em dendrites neuronal. Após 24 h de incubação, os copos fagocíticos foram levemente solubilizados com detergente e coletados por meio de um separador magnético. Após a lavagem dos grânulos, as proteínas de ligação foram eluidas e analisadas por coloração de prata e western blotting. Na fração de ligação, TLCN e actina estavam abundantemente presentes. Além, muitas proteínas identificadas da fração foram localizadas ao filopodia dendríticas; assim, denominamos a fração de ligação como a fração rica em filopóticos dendrítico. Este artigo descreve detalhes a respeito do método da purificação para a fração filopodia-rica dendríticas.
Introduction
O filopódia dendrítico é pensado para ser precursores dos espinhas. Os filamentos de actina no filopódia dendrítico regulam sua extensão e retração1,2,3. Depois de entrar em contato com um axão, o filopódia dendrítico selecionado começa sua maturação em espinhos, e uma sinapse é formada em4,5. Componentes de espinhos foram determinados a partir da análise abrangente das frações de densidade pós-sináptica6,7, enquanto os componentes de filopódia dendrítico permanecem em grande parte desconhecidos. Demonstrou-se que a telencérola (tlcn), erm, syngap, Ras, ARF6 quinase, Akt, mTOR, Polo-como a quinase 2, camkii, syndecan-2, paralemin-1, e ephb regulam a formação dendrítica defilopódia5,8,9 ,10,11, enquanto um método não foi desenvolvido para a análise abrangente de moléculas presentes no filopódio dendrítico.
Tlcn (ICAM-5) é expressado especificamente por neurônios spiny no segmento o mais rostral do cérebro, o telencéfalo12. Tlcn tem 9 domínios do IG-like em sua região extracelular, uma região do transmembrana, e uma cauda cytoplasmic13. A tlcn liga-se à vitronectina (vn) e à integrina LFA-1 em sua região extracelular, à presenilina em sua região transmembranar e ao fosho-ERM e α-actinina em sua região citoplasmática5,8,14,15 ,16. Tlcn liga-se ao citoesqueleto de actina através de fosho-ERM nas pontas de filopódia dendrítico e α-actinina em espinhos e eixos dendríticos8,16.
Nós mostramos que o superexpressão de tlcn aumentou a formação dendríticas do filopódia e induziu a reversão dos espinhos ao filopódia10. A forma ativa constitutiva de Ezrin ligada à região citoplasmática do TLCN e a formação de filopótico dendrítica reforçada8. Assim, a TLCN regula a formação de filopódios dendríticos através de proteínas de ligação actina. Esselens et al. demonstraram que microgrânulos induziu acúmulo de TLCN em neurônios cultivados17. Nós mostramos que as estruturas fagocitária do copo foram dadas forma em dendritos neuronal em torno dos microesferas vn-revestidos em uma maneira tlcn-dependente15. Constituintes de filopódios dendríticos são semelhantes aos do copo fagocitítico. É difícil coletar filopódios dendríticos, mas é relativamente mais fácil coletar o copo fagocitítico usando microgrânulos magnéticos. Assim, desenvolvemos um método para purificar o copo fagocitítico em vez de filopódia dendrítico18. Aqui, nós descrevemos o método da purificação para a fração filopodia-rica dendríticas.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nós desenvolvemos um método da purificação para a fração filopodia-rica dendríticas usando a afinidade entre a molécula tlcn da adesão da pilha e a vitronectina extracelular da proteína da matriz. Comparado à fração PSD, pode ser possível identificar as proteínas sinápticas atuando na sinapse imatura da fração dendrítica rica em filopodia. Assim, os constituintes da fração dendrítica filopodia-rica são diferentes dos da fração PSD em 74%. Diferente da fração PSD, usamos neurônios hipocampais c…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos Shigeo Okabe e Hitomi Matsuno pela cultura de baixa densidade de neurônios hipocampais, Masayoshi Mishina para camundongos deficientes em TLCN, Sachiko Mitsui e Momoko Shiozaki para assistência técnica, e membros do laboratório Yoshihara para discussões úteis . Este trabalho foi apoiado por JSPS KAKENHI Grant nos. JP20700307, JP22700354, e JP24500392 e MEXT KAKENHI Grant nos. JP23123525 para YF e JP20022046, JP18H04683 e JP18H05146 para YY.
Materials
| 1 M HEPES | Gibco | 15630-080 | |
| 1.7 ml Low Binding MCT | Sorenson BioScience | 39640T | |
| 200 mM L-Glutamine | Gibco | 2530149 | |
| 35-mm plastic cell culture dishes | Corning | 430165 | |
| Anti-actin | Sigma-Aldrich | A-5060 | |
| Anti-alpha-Actinin | Sigma-Aldrich | A-5044 | |
| Anti-alpha-tubulin | Sigma-Aldrich | T-9026 | |
| Anti-Ezrin | Sigma-Aldrich | clone3C12, SAB4200806 | |
| Anti-Galphaq | Santacruz | sc-393 | |
| Anti-MAP2 | Chemicon | clone AP20, MAB3418 | |
| Anti-Moesin | Sigma-Aldrich | clone 38/87, M7060 | |
| Anti-PLCbeta1 | Santacuz | sc-5291 | |
| Anti-PSD95 | MA2 | ABR | |
| Anti-Spectrin beta | Chemicon | MAB1622 | |
| B27 | Gibco | 0080085SA | |
| BCA protein assay kit | Thermo | 23227 | |
| Bromophenol blue | Merck | 1.08122.0005 | |
| calcium chrolide, hydrous | Wako | 038-19735 | |
| Cell scraper | Falcon | 353085 | |
| Cell strainer | Falcon | 352350 | |
| Choline chloride | Sigma-Aldrich | C7527 | |
| Complete EDTA free protease inhibitor cocktail | Roche | 11873580001 | |
| Cytosine beta-D-arabinofuranoside | Sigma-Aldrich | C-6645 | |
| DNase-I | Sigma-Aldrich | DN-25 | |
| D-Pantothenic acid hemicalcium salt | Sigma-Aldrich | P5155 | |
| DynaMag-2 Magnet | Thermo | 12321D | |
| ECL Prime Western Blotting Detection Reagent | GE | RPN2232 | |
| e-PAGEL 5-20% SDS-PAGE gradient gel | ATTO | E-T520L | |
| Folic acid | Sigma-Aldrich | F8758 | |
| HBSS | Gibco | 14175095 | |
| HRP-conjugated anti-rabbit IgG | Jackson ImmunoResearch | 111-035-144 | |
| i-Inositol | Sigma-Aldrich | I7508 | |
| LAS-1000 mini | Fuji Film | LAS-1000 mini | For detection of luminescence from WB membrane |
| Magnetic polystyrene microbeads | Sperotech | PM-20-10 | |
| MEM amino acid solution | Gibco | 11130-051 | 30 mM L-Arginine hydrochloride, 5 mM L-Cystine, 10 mM L-Histidine hydrochloride-H2O, 20 mM L-Isoleucine, 20 mM L-Leucine, 19.8 mM L-Lysine hydrochloride, 5.1 mM L-Methionine, 10 mM L-Phenylalanine, 20 mM L-Threonine, 2.5 mM L-Tryptophan, 10 mM L-Tyrosine, and 20 mM L-Valine |
| Mini-slab size electrophoresis system | ATTO | AE-6530 | |
| Niacinamide | Sigma-Aldrich | N0636 | |
| Penicilin / Streptomycin | Gibco | 15070063 | |
| PhosSTOP phosphatase inhibitor cocktail | Roche | 4906845001 | |
| Poly-L-lysine hydrobromide | Nacali | 28360-14 | |
| Pyridoxal HCl | Sigma-Aldrich | P6155 | |
| Riboflavin | Sigma-Aldrich | R9504 | |
| Silver Stain 2 Kit wako | Wako | 291-5031 | |
| Thiamine HCl | Sigma-Aldrich | T1270 | |
| Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell | Bio-rad | 1703940JA | |
| Ultra pure water | MilliQ | For production of ultra pure water |
References
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