I denne protokollen introduserer vi en metode for rensing av dendrittiske filopodia fraksjon fra phagocytic Cup-lignende protrusion struktur på kultivert hippocampus neurons ved å utnytte den spesifikke og sterke affinitet mellom en dendrittiske filopodial vedheft molekyl, TLCN, og en ekstracellulære matrise molekyl, vitronectin.
Dendrittiske filopodia er tynne og lange utstikkende basert på utgangen filament, og de strekker og trekker seg som om du søker etter et mål axon. Når dendrittiske filopodia etablere kontakt med en mål axon, begynner de å modnes i pigger, noe som fører til dannelsen av en synapse. Telencephalin (TLCN) er rikelig lokalisert i dendrittiske filopodia og blir gradvis ekskludert fra pigger. Overuttrykte av TLCN i kultivert hippocampus neurons induserer dendrittiske filopodia formasjon. Vi viste at telencephalin sterkt binder seg til en ekstracellulære matrise molekyl, vitronectin. Vitronectin-belagt mikroperler indusert phagocytic kopp formasjon på neuronal dendrites. I phagocytic Cup, TLCN, TLCN-bindende proteiner som fosforylert Ezrin/Radixin/Moesin (fosfat-ERM), og F-utgangen er akkumulert, noe som tyder på at komponentene i phagocytic koppen er lik de av dendrittiske filopodia. Derfor utviklet vi en metode for rensing av phagocytic koppen i stedet for dendrittiske filopodia. Magnetiske polystyren perler var belagt med vitronectin, som er rikelig til stede i kulturen medium for hippocampus neurons og som induserer phagocytic kopp formasjon på neuronal dendrites. Etter 24 h av inkubasjons, phagocytic koppene var mildt solubilized med vaskemiddel og samlet inn ved hjelp av en magnet separator. Etter vask av perlene, ble de bindende proteinene eluert og analysert av sølv flekker og vestlig blotting. I bindingen brøk, TLCN og utgangen var rikelig til stede. I tillegg ble mange proteiner identifisert fra fraksjonen lokalisert til dendrittiske filopodia; dermed kalte vi bindingen brøk som dendrittiske filopodia-rik brøk. Denne artikkelen beskriver detaljer om rensing metoden for dendrittiske filopodia-rik brøk.
Dendrittiske filopodia antas å være forløpere for pigger. Utgangen filamenter i dendrittiske filopodia regulere sin forlengelse og uttrekk1,2,3. Etter å ha kontaktet en axon, valgte dendrittiske filopodia begynne sin modning i pigger, og en synapse er dannet4,5. Komponenter av pigger har blitt bestemt fra omfattende analyse av postsynaptic tetthet fraksjoner6,7, mens komponenter av dendrittiske filopodia fortsatt i stor grad ukjent. Det har blitt vist at telencephalin (TLCN), erm, SynGAP, RAS, PI3 kinase, akt, mTOR, Polo-like kinase 2, CaMKII, syndecan-2, paralemin-1, ARF6, og EphB regulere dendrittiske filopodia formasjon5,8,9 ,10,11, mens en metode ikke er utviklet for den omfattende analyse av molekyler til stede i dendrittiske filopodia.
TLCN (ICAM-5) er spesielt uttrykt ved spiny neurons i de mest rostral hjernen segmentet, Telencephalon12. TLCN har 9 IG-lignende domener i sin ekstracellulære region, en transmembrane region, og en cytoplasmatiske hale13. TLCN binder seg til vitronectin (vn) og LFA-1 integrin i sin ekstracellulære region, til presenilin i sin transmembrane region, og til fosfat-erm og α-actinin i sin cytoplasmatiske region5,8,14,15 ,16. TLCN binder seg til utgangen cytoskeleton gjennom fosfat-erm på tuppen av dendrittiske filopodia og α-actinin i pigger og dendrittiske aksler8,16.
Vi viste at overuttrykte av TLCN forbedret dendrittiske filopodia formasjon og indusert reversion av pigger til filopodia10. Den konstituerende aktive formen av Ezrin bundet til TLCN cytoplasmatiske regionen og forbedret dendrittiske filopodia formasjon8. Således regulerer TLCN dendrittiske filopodia formasjon gjennom utgangen-bindende proteiner. Esselens et al. demonstrerte at mikroperler indusert TLCN akkumulering på kultivert neurons17. Vi viste at phagocytic Cup strukturer ble dannet på neuronal dendrites rundt VN-belagt mikroperler i en TLCN-avhengig måte15. Bestanddeler av dendrittiske filopodia er lik de av phagocytic koppen. Det er vanskelig å samle dendrittiske filopodia, men det er relativt lettere å samle phagocytic koppen ved hjelp av magnetisk mikroperler. Dermed har vi utviklet en metode for å rense phagocytic koppen i stedet for dendrittiske filopodia18. Her beskriver vi rensing metoden for dendrittiske filopodia-rik brøk.
Vi utviklet en rensing metode for dendrittiske filopodia-rike brøkdel ved hjelp av affinitet mellom celle vedheft molekylet TLCN og ekstracellulære Matrix protein vitronectin. Sammenlignet med PSD brøkdel, kan det være mulig å identifisere Synaptic proteiner opptrer på umodne synapse fra dendrittiske filopodia-rik brøk. Dermed er bestanddelene av dendrittiske filopodia-rik brøk er forskjellig fra de av PSD brøkdel av 74%. Forskjellig fra PSD brøkdel, brukte vi kultivert hippocampus neurons å aktivt danne phago…
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Shigeo Okabe og Hitomi Matsuno for lav tetthet kultur hippocampus neurons, Masayoshi Mishina for TLCN-mangelfull mus, Sachiko Mitsui og Momoko Shiozaki for teknisk assistanse, og medlemmer av Yoshihara laboratoriet for nyttige diskusjoner . Dette arbeidet ble støttet av JSP KAKENHI Grant NOS. JP20700307, JP22700354 og JP24500392 og MEXT KAKENHI Grant NOS. JP23123525 til YF og JP20022046, JP18H04683 og JP18H05146 til åå.
1 M HEPES | Gibco | 15630-080 | |
1.7 ml Low Binding MCT | Sorenson BioScience | 39640T | |
200 mM L-Glutamine | Gibco | 2530149 | |
35-mm plastic cell culture dishes | Corning | 430165 | |
Anti-actin | Sigma-Aldrich | A-5060 | |
Anti-alpha-Actinin | Sigma-Aldrich | A-5044 | |
Anti-alpha-tubulin | Sigma-Aldrich | T-9026 | |
Anti-Ezrin | Sigma-Aldrich | clone3C12, SAB4200806 | |
Anti-Galphaq | Santacruz | sc-393 | |
Anti-MAP2 | Chemicon | clone AP20, MAB3418 | |
Anti-Moesin | Sigma-Aldrich | clone 38/87, M7060 | |
Anti-PLCbeta1 | Santacuz | sc-5291 | |
Anti-PSD95 | MA2 | ABR | |
Anti-Spectrin beta | Chemicon | MAB1622 | |
B27 | Gibco | 0080085SA | |
BCA protein assay kit | Thermo | 23227 | |
Bromophenol blue | Merck | 1.08122.0005 | |
calcium chrolide, hydrous | Wako | 038-19735 | |
Cell scraper | Falcon | 353085 | |
Cell strainer | Falcon | 352350 | |
Choline chloride | Sigma-Aldrich | C7527 | |
Complete EDTA free protease inhibitor cocktail | Roche | 11873580001 | |
Cytosine beta-D-arabinofuranoside | Sigma-Aldrich | C-6645 | |
DNase-I | Sigma-Aldrich | DN-25 | |
D-Pantothenic acid hemicalcium salt | Sigma-Aldrich | P5155 | |
DynaMag-2 Magnet | Thermo | 12321D | |
ECL Prime Western Blotting Detection Reagent | GE | RPN2232 | |
e-PAGEL 5-20% SDS-PAGE gradient gel | ATTO | E-T520L | |
Folic acid | Sigma-Aldrich | F8758 | |
HBSS | Gibco | 14175095 | |
HRP-conjugated anti-rabbit IgG | Jackson ImmunoResearch | 111-035-144 | |
i-Inositol | Sigma-Aldrich | I7508 | |
LAS-1000 mini | Fuji Film | LAS-1000 mini | For detection of luminescence from WB membrane |
Magnetic polystyrene microbeads | Sperotech | PM-20-10 | |
MEM amino acid solution | Gibco | 11130-051 | 30 mM L-Arginine hydrochloride, 5 mM L-Cystine, 10 mM L-Histidine hydrochloride-H2O, 20 mM L-Isoleucine, 20 mM L-Leucine, 19.8 mM L-Lysine hydrochloride, 5.1 mM L-Methionine, 10 mM L-Phenylalanine, 20 mM L-Threonine, 2.5 mM L-Tryptophan, 10 mM L-Tyrosine, and 20 mM L-Valine |
Mini-slab size electrophoresis system | ATTO | AE-6530 | |
Niacinamide | Sigma-Aldrich | N0636 | |
Penicilin / Streptomycin | Gibco | 15070063 | |
PhosSTOP phosphatase inhibitor cocktail | Roche | 4906845001 | |
Poly-L-lysine hydrobromide | Nacali | 28360-14 | |
Pyridoxal HCl | Sigma-Aldrich | P6155 | |
Riboflavin | Sigma-Aldrich | R9504 | |
Silver Stain 2 Kit wako | Wako | 291-5031 | |
Thiamine HCl | Sigma-Aldrich | T1270 | |
Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell | Bio-rad | 1703940JA | |
Ultra pure water | MilliQ | For production of ultra pure water |