Переходных выражение в красной свеклы биофармацевтической кандидат вакцины для типа-1 мочеизнурения

Summary

Здесь мы представляем протокол производить кандидат оральная вакцина против диабета типа 1 в съедобных растений.

Abstract

Завод молекулярных земледелие является использование растений для производства молекулы интерес. В этой перспективе растения могут использоваться как биореакторов для последующей очистки конечного продукта и производства и прямых перорального гетерологичных белков при использовании видов съедобных растений. В этой работе мы представляем развития кандидата оральная вакцина против диабета 1 типа (T1D) в системах съедобных растений с использованием деконструкции растений на основе вирус рекомбинатной технологии дна, поставляется с вакуумной инфильтрации. Наши результаты показывают, что красная свекла является подходящей принимающей для переходных выражение человека производные аутоантиген, связанные с T1D, считается перспективным кандидатом как T1D вакцина. Листья, производства аутоантиген были тщательно характерны для их сопротивление желудочного пищеварения, наличие остаточного заряда бактерий и их вторичного метаболизма профиля, давая обзор процесса производства для потенциального использования растений для прямого перорального гетерологичных белка. Наш анализ показал почти полной деградации лиофилизированной кандидат пероральной вакциной после имитации желудочного пищеварения, предполагая, что стратегию инкапсуляции в производстве вакцины растительного ГАД не требуется.

Introduction

После революции молекулярной биологии растений в 1980-х систем на базе завода для производства биофармацевтических препаратов может рассматриваться как альтернатива традиционным системам на основе клеток микробов и млекопитающих¹. Растения отображать несколько преимуществ перед традиционными платформами, с масштабируемости, эффективности и безопасности, будучи наиболее релевантные². Рекомбинантных продукта может быть очищенной от преобразованного растительной ткани и затем управлением, либо парентерально или устно и, Кроме того, преобразованные съедобных растений может использоваться непосредственно для перорального. Пероральном одновременно содействует слизистых оболочек и системного иммунитета, и это устраняет необходимость иглы и специализированного медицинского персонала. Кроме того перорального устраняет сложной обработке, который обычно приходится 80% от стоимости всего производство рекомбинантных белков³. Все эти преимущества могут быть переведены в экономии средств производства, поставок и труда, снижения расходов по каждой дозы, что делает препарат доступным для большинства мирового населения.

Несколько стратегий, как стабильная трансформации и переходных выражение, были разработаны для производства рекомбинантных белков в растениях. Среди них высокодоходные деконструкции завод на базе вирус выражение системы (например, magnICON) обеспечивает превосходную производительность ведущих высокие урожаи рекомбинантных белков в относительно короткие сроки⁴. Многие примеры переходных выражения с использованием системы на основе вирус выражение завод в растения Nicotiana benthamiana сообщается, будучи принимающей золотой стандарт производства. Однако эта модель завод не рассматривается как съедобных видов алкалоидов и других токсичных метаболитов, которые накапливаются в его листьях.

В этой работе, мы описываем сравнение между двумя системами съедобных растений, красная свекла (бета vulgaris cv Мулен Руж) и шпинат (Spinacea oleracea cv Industria), для выражения два кандидата форм 65 кДа изоформы глутаминовой кислоты Декарбоксилаза (GAD65), проведенного на заводе на базе вирус векторы⁵. GAD65 основных аутоантиген, связанные с диабетом 1 типа (T1D) и это в настоящее время под следствием в человека клинические испытания, чтобы предотвратить или отсрочить T1D, вызывая терпимости⁶. Производство GAD65 в растения широко учился в модель видов растений Nicotiana tabacum и н. benthamiana^4,5,6,7. Здесь мы описывают использование видов съедобных растений для производства молекулы в тканях, которые могут быть предназначены для прямой доставки устные. С технической точки зрения, мы изучали и выбрали системы для agroinfiltration растений и съедобных растений платформы GAD65 производства путем оценки различных параметров: рекомбинантных белков уровнях, остаточная микробной заряд на заводе ткани, предназначенные для перорального, сопротивление GAD65 желудочного пищеварения и биоэквивалентности трансформированных растений с дикого типа.

Protocol

1. красный выращивания свеклы и шпинатом Расти красной свеклы (B. vulgaris cv Мулен Руж) и шпината (S. oleracea cv Industria) растений в камере роста, используя 150 µE интенсивности света, относительная влажность 65%, 12 h свет/темно цикла в 23/21 ° C, соответственно. После прорастания семян Удо?…

Representative Results

В этой работе представлен рабочий процесс для развития устной вакцины в тканях съедобных растений. В центре внимания этой работы является выражением целевого белка в съедобных принимающей видов растений и характеристика потенциальных пероральной вакциной. <p class="jo…

Discussion

В этом исследовании мы показали предварительный анализ для разработки кандидат оральная вакцина для аутоиммунного диабета. Целевого белка для этого эксперимента был мутировал форме человека 65 кДа Глутаматдекарбоксилаза, которых производство и функциональность являются легко обнар?…

Materials

0.2-μm Minisart RC4 membrane filters	Sartorius-Stedim	17764
2–mercaptoethanol	Sigma	M3148	Toxic; 4 % to make loading buffer with glycerol, SDS and Tris-HCl
4-Morpholineethanesulfonic acid (MES)	Sigma	M8250	pH 5.5
96-well plate	Sarstedt	833924
Acetic acid	Sigma	27221	Corrosive
Acetonitrile LC-MS grade	Sigma	34967
Acetosyringone	Sigma	D134406	Toxic – 0.1 M stock in DMSO
Agar Bacteriological Grade	Applichem	A0949	15 g/L to make LB medium (pH 7.5 with NaOH) with Yeast extract, NaCl and Tryptone
Ammonium formate	Sigma	70221
Anti-eGFP antibody	ABCam	ab290
Anti-GAD 65/67 antibody	Sigma	G5163
Anti-LHCB2 antibody	Agrisera	AS01 003
Brilliant Blue R-250	Sigma	B7920
C18 Column	Grace	–	Alltima HP C18 (150 mm x 2.1 mm; 3 μm) Column
C18 Guard Column	Grace	–	Alltima HP C18 (7.5 mm x 2.1 mm; 5 μm) Guard  Column
CalMag Grower	Peter Excel	15-5-15	Fertilizer
Carbenicillin disodium	Duchefa Biochemie	C0109	Toxic
Chemiluminescence imaging system	BioRad	1708370	ChemiDoc Touch Imaging System
Chloroform	Sigma	C2432
Detergent	Sigma	P5927	Polysorbate 20
Fluorescence reader	Perkin-Elmer	1420-011	VICTOR Multilabel Counter
Formic acid LC-MS grade	Sigma	94318
Glycerol	Sigma	G5516	15 % to make loading buffer with Tris-HCl, SDS and 2–mercaptoethanol
GoTaq G2 polymerase	Promega	M7841
HCl	Sigma	H1758	Corrosive
HILIC Column	Grace	–	Ascentis Express HILIC (150 mm x 2.1 mm; particles size 2.7 μm) Column
HILIC Guard Column	Grace	–	Vision HT HILIC (7.5 mm x 2.1 mm; 3 μm) Guard  Column
Horseradish peroxidase (HRP)-conjugate anti-rabbit antibody	Sigma	A6154	Do not freeze/thaw too many times
HPLC Autosampler	Beckman Coulter	–	System Gold 508 Autosampler
HPLC System	Beckman Coulter	–	System Gold 128 Solvent Module HPLC
Isopropanol	Sigma	24137	Flamable
Kanamycin sulfate	Sigma	K4000	Toxic
KCl	Sigma	P9541	2 g/L with NaCl , Na2HPO4 and KH2PO4 to make PBS
KH2PO4	Sigma	P9791	2.4 g/L with NaCl , Na2HPO4 and KCl to make PBS
Loading Buffer
Luminol solution	Ge Healthcare	RPN2232	Prepare the solution using the ECL Prime Western Blotting System commercial kit
Lyophilizator	5Pascal	LIO5P0000DGT
Mass Spectometer	Bruker Daltonics	–	Bruker Esquire 6000; the mass spectrometer was equipped with an ESI source and the analyzer was an ion trap
Methanol	Sigma	32213
MgSO4	Sigma	M7506
Milk-blocking solution	Ristora	–	3 % in PBS
Na2HPO4	Sigma	S7907	Use with NaH2PO4 to make Sodium Phospate buffer
NaCl	Sigma	S3014	80 g/L with KCl, Na2HPO4 and KH2PO4 to make PBS; 10 g/L to make LB medium (pH 7.5 with NaOH) with Yeast extract, Tryptone and Agar Bacteriological Grade
NaH2PO4	Sigma	S8282	Use with Na2HPO4 to make Sodium Phospate buffer; 14.4 g/L to make PBS
NaOH	Sigma	S8045
Nitrocellulase membrane	Ge Healthcare	10600002
Pepsin from porcine gastric mucosa	Sigma	P7000
Peroxidase substrate ECL	GE Healthcare	RPN2235	Light sensitive material
Pump Vacuum Press	VWR	111400000098
Reagent A	Sigma	B9643	Use 50 parts of this reagent with 1 part of reagent B to prepare BCA working solution
Reagent B	Sigma	B9643	Use 1 part of this reagent with 50 parts of reagent A to prepare BCA working solution
Rifampicin	Duchefa Biochemie	R0146	Toxic – 25 mg/mL stock in DMSO
SDS (Sodium dodecyl sulphate)	Sigma	L3771	Flamable, toxic, corrosive-10 % stock; 3 % to make loading buffer with Tris-HCl, Glycerol and 2–mercaptoethanol
Sodium metabisulphite	Sigma	7681-57-4
Sonicator system	Soltec	090.003.0003	Sonica® 2200 MH; frequency 40 khz
Syringe	Terumo	–
Transparent fixed 300-µL insert glass tubes	Thermo Scientific	11573680
Trizma Base	Sigma	T1503	Adjust pH with 1N HCl to make Tris-HCl buffer, use 1,5M Tris-HCl (pH 6.8) to make loading buffer with SDS, Glycerol and 2–mercaptoethanol
Tryptone	Formedium	TRP03	10 g/L to make LB medium (pH 7.5 with NaOH) with Yeast extract, NaCl and Agar Bacteriological Grade
Vacuum concentrator	Heto	3878 F1-3	Speed-vac System
Water LC-MS grade	Sigma	39253
Yeast extract	Sigma	Y1333	5 g/L to make LB medium (pH 7.5 with NaOH) with Tryptone, NaCl and Agar Bacteriological Grade