Kırmızı pancar biyofarmasotik aday aşısı geçici ifadede tip 1 diyabet için
Summary
Burada, bir sözlü aşı adayı karşı tip 1 diyabet bir yenilebilir bitki üretmek için bir protokol mevcut.
Abstract
Bitki moleküler tarım bitkiler ilgi molekülleri üretmek için kullanılır. Bu açıdan, bitkiler hem Biyoreaktörler olarak üretim ve nihai ürünün sonraki arıtma ve kapaklı proteinlerin doğrudan oral teslimat için Yenilebilir bitki türü kullanılırken kullanılabilir. Bu çalışmada, Yenilebilir bitki sistemleri ile vakum infiltrasyon teslim deconstructed bitki virüs tabanlı rekombinant DNA teknolojisi kullanılarak tip 1 diyabet (T1D) karşı bir aday sözlü aşı geliştirilmesi mevcut. Sonuçlarımız kırmızı pancar T1D aşı olarak umut verici bir aday olarak kabul T1D, ilişkili bir insan türetilmiş autoantigen geçici bir ifade için uygun bir ev sahibi olduğunu gösteriyor. Autoantigen üreten yaprakları iyice mide sindirim için onların direnci, bakteriyel şarj kalıntısı varlığı ve ikincil metabolik profilleri, işlem üretim potansiyelini kullanmak için genel bir bakış vermek için karakterize bitkilerin kapaklı bir protein doğrudan oral teslimat için. Bizim analiz neredeyse tam bir kapsülleme strateji bitki kaynaklı GAD aşı üretiminde gerekli olduğunu düşündüren bir simüle mide sindirim takip dondurularak aday sözlü aşı düşüşü gösterdi.
Introduction
Bitki moleküler biyoloji devriminden bu yana 1980’li yıllarda, bitki tabanlı sistemler Biyofarmasötikler üretimi için alternatif mikrobiyal ve memeli hücreleri1üzerinde esaslı geleneksel sistem olarak kabul edilebilir. Bitkiler geleneksel platformlar, çeşitli avantajlar ölçeklenebilirlik, maliyet-etkililik ve en alakalı2güvenlik ile görüntüler. Rekombinant ürün dönüştürülmüş bitki dokudan saflaştırılmış ve sonra yönetilen, ya parenterally ya da sözlü olarak ve ayrıca, dönüştürülmüş Yenilebilir bitki doğrudan oral teslimat için kullanılabilir. Sözlü rota aynı anda Mukozal ve sistemik bağışıklık teşvik ve iğneler ve uzman sağlık personeli için gereksinimini ortadan kaldırır. Ayrıca, oral teslimat normalde rekombinant protein3Toplam üretim maliyetinin % 80’i hesapları karmaşık aşağı akım işleme ortadan kaldırır. Bütün bu avantajları tasarruf üretim, malzeme ve ilaç dünya nüfusunun çoğu için uygun hale her doz maliyetlerini azaltarak emek doğru tercüme edilebilir.
Çeşitli stratejiler, hem istikrarlı dönüşümü ve geçici ifade, bitkilerde rekombinant proteinlerin üretimi için geliştirilmiştir. Bunlar arasında yüksek verimli deconstructed bitki virüs temel ifade sistemi (örneğin, magnICON) rekombinant proteinlerin yüksek verim nispeten kısa zaman çizelgelerine4üzerinde önde gelen üstün performans sağlar. Geçici ifade Nicotiana benthamiana bitkilerde bitki virüs temel ifade sistemi kullanarak pek çok örnek, altın standart üretim ev sahibi olmak raporlanır. Ancak, bu model bitki alkoloidler ve yaprakları içinde birikmiş olan diğer toksik metabolitleri nedeniyle yenilebilir bir tür olarak kabul edilmez.
Bu çalışmada, biz iki Yenilebilir bitki sistemi, kırmızı pancar arasında karşılaştırma tarif (Beta vulgaris cv Moulin Rouge) ve ıspanak (Spinacea oleracea cv Industria), 65 kDa izoformu glutamik asit iki aday türde bir ifade için bitki virüs tabanlı tarafından yürütülen dekarboksilaz (GAD65),5Vektörler. GAD65 tip 1 diyabet (T1D) ilişkili bir büyük autoantigen ve bu şu anda önlemek veya T1D tolerans6inducing tarafından gecikme insan klinik çalışmalarda soruşturma altında. GAD65 üretim tesislerinde kapsamlı modeli bitki türleri içinde tütün ve i. benthamiana4,5,6,7çalışılmıştır. Burada, biz doğrudan sözlü teslim için demek dokularda molekül üretimi için Yenilebilir bitki türlerinin nasıl kullanılacağını açıklar. –Dan teknik görüş, okudu ve bitki agroinfiltration için sistemi ve Yenilebilir bitki platformu GAD65 üretim için farklı parametreler değerlendirilerek seçilen: rekombinant protein ifade seviyeleri, bitki mikrobiyal şarj kalıntısı doku’sözlü dır, GAD65 mide sindirim için direnç ve vahşi türü ile dönüştürülmüş bitkilerin bioequivalence demek istedim.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu çalışmada otoimmün şeker hastalığı için bir aday sözlü aşı tasarımı için ön analizler gösterdi. Bu deneme için hedef proteini insan 65 kDa Glutamat dekarboksilaz, hangi üretim ve işlevselliği kolayca ortaya ve ölçülebilir12olduğunu mutasyona uğramış biçimiydi. Onun ifade farklı Yenilebilir bitki dokularında vektörel çizimler tarafından5, hangi rekombinant protein üretim çok kısa bir süre içinde yüksek düzeyde aracılık aracılı…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu eser ortak projesi “Bitkilerin kullanımı bir otoimmün diyabet yenilebilir aşısı (eDIVA) üretimi için” tarafından desteklenmiştir (Proje kodu: 891854) çağrı 2014 çerçevesinde Verona Üniversitesi tarafından finanse edilmektedir.
Materials
| 0.2-μm Minisart RC4 membrane filters | Sartorius-Stedim | 17764 | |
| 2–mercaptoethanol | Sigma | M3148 | Toxic; 4 % to make loading buffer with glycerol, SDS and Tris-HCl |
| 4-Morpholineethanesulfonic acid (MES) | Sigma | M8250 | pH 5.5 |
| 96-well plate | Sarstedt | 833924 | |
| Acetic acid | Sigma | 27221 | Corrosive |
| Acetonitrile LC-MS grade | Sigma | 34967 | |
| Acetosyringone | Sigma | D134406 | Toxic – 0.1 M stock in DMSO |
| Agar Bacteriological Grade | Applichem | A0949 | 15 g/L to make LB medium (pH 7.5 with NaOH) with Yeast extract, NaCl and Tryptone |
| Ammonium formate | Sigma | 70221 | |
| Anti-eGFP antibody | ABCam | ab290 | |
| Anti-GAD 65/67 antibody | Sigma | G5163 | |
| Anti-LHCB2 antibody | Agrisera | AS01 003 | |
| Brilliant Blue R-250 | Sigma | B7920 | |
| C18 Column | Grace | – | Alltima HP C18 (150 mm x 2.1 mm; 3 μm) Column |
| C18 Guard Column | Grace | – | Alltima HP C18 (7.5 mm x 2.1 mm; 5 μm) Guard Column |
| CalMag Grower | Peter Excel | 15-5-15 | Fertilizer |
| Carbenicillin disodium | Duchefa Biochemie | C0109 | Toxic |
| Chemiluminescence imaging system | BioRad | 1708370 | ChemiDoc Touch Imaging System |
| Chloroform | Sigma | C2432 | |
| Detergent | Sigma | P5927 | Polysorbate 20 |
| Fluorescence reader | Perkin-Elmer | 1420-011 | VICTOR Multilabel Counter |
| Formic acid LC-MS grade | Sigma | 94318 | |
| Glycerol | Sigma | G5516 | 15 % to make loading buffer with Tris-HCl, SDS and 2–mercaptoethanol |
| GoTaq G2 polymerase | Promega | M7841 | |
| HCl | Sigma | H1758 | Corrosive |
| HILIC Column | Grace | – | Ascentis Express HILIC (150 mm x 2.1 mm; particles size 2.7 μm) Column |
| HILIC Guard Column | Grace | – | Vision HT HILIC (7.5 mm x 2.1 mm; 3 μm) Guard Column |
| Horseradish peroxidase (HRP)-conjugate anti-rabbit antibody | Sigma | A6154 | Do not freeze/thaw too many times |
| HPLC Autosampler | Beckman Coulter | – | System Gold 508 Autosampler |
| HPLC System | Beckman Coulter | – | System Gold 128 Solvent Module HPLC |
| Isopropanol | Sigma | 24137 | Flamable |
| Kanamycin sulfate | Sigma | K4000 | Toxic |
| KCl | Sigma | P9541 | 2 g/L with NaCl , Na2HPO4 and KH2PO4 to make PBS |
| KH2PO4 | Sigma | P9791 | 2.4 g/L with NaCl , Na2HPO4 and KCl to make PBS |
| Loading Buffer | |||
| Luminol solution | Ge Healthcare | RPN2232 | Prepare the solution using the ECL Prime Western Blotting System commercial kit |
| Lyophilizator | 5Pascal | LIO5P0000DGT | |
| Mass Spectometer | Bruker Daltonics | – | Bruker Esquire 6000; the mass spectrometer was equipped with an ESI source and the analyzer was an ion trap |
| Methanol | Sigma | 32213 | |
| MgSO4 | Sigma | M7506 | |
| Milk-blocking solution | Ristora | – | 3 % in PBS |
| Na2HPO4 | Sigma | S7907 | Use with NaH2PO4 to make Sodium Phospate buffer |
| NaCl | Sigma | S3014 | 80 g/L with KCl, Na2HPO4 and KH2PO4 to make PBS; 10 g/L to make LB medium (pH 7.5 with NaOH) with Yeast extract, Tryptone and Agar Bacteriological Grade |
| NaH2PO4 | Sigma | S8282 | Use with Na2HPO4 to make Sodium Phospate buffer; 14.4 g/L to make PBS |
| NaOH | Sigma | S8045 | |
| Nitrocellulase membrane | Ge Healthcare | 10600002 | |
| Pepsin from porcine gastric mucosa | Sigma | P7000 | |
| Peroxidase substrate ECL | GE Healthcare | RPN2235 | Light sensitive material |
| Pump Vacuum Press | VWR | 111400000098 | |
| Reagent A | Sigma | B9643 | Use 50 parts of this reagent with 1 part of reagent B to prepare BCA working solution |
| Reagent B | Sigma | B9643 | Use 1 part of this reagent with 50 parts of reagent A to prepare BCA working solution |
| Rifampicin | Duchefa Biochemie | R0146 | Toxic – 25 mg/mL stock in DMSO |
| SDS (Sodium dodecyl sulphate) | Sigma | L3771 | Flamable, toxic, corrosive-10 % stock; 3 % to make loading buffer with Tris-HCl, Glycerol and 2–mercaptoethanol |
| Sodium metabisulphite | Sigma | 7681-57-4 | |
| Sonicator system | Soltec | 090.003.0003 | Sonica® 2200 MH; frequency 40 khz |
| Syringe | Terumo | – | |
| Transparent fixed 300-µL insert glass tubes | Thermo Scientific | 11573680 | |
| Trizma Base | Sigma | T1503 | Adjust pH with 1N HCl to make Tris-HCl buffer, use 1,5M Tris-HCl (pH 6.8) to make loading buffer with SDS, Glycerol and 2–mercaptoethanol |
| Tryptone | Formedium | TRP03 | 10 g/L to make LB medium (pH 7.5 with NaOH) with Yeast extract, NaCl and Agar Bacteriological Grade |
| Vacuum concentrator | Heto | 3878 F1-3 | Speed-vac System |
| Water LC-MS grade | Sigma | 39253 | |
| Yeast extract | Sigma | Y1333 | 5 g/L to make LB medium (pH 7.5 with NaOH) with Tryptone, NaCl and Agar Bacteriological Grade |
References
- Merlin, M., Pezzotti, M., Avesani, L. Edible plants for oral delivery of biopharmaceuticals. British Journal of Clinical Pharmacology. 83 (1), 71-81 (2017).
- Merlin, M., Gecchele, E., Capaldi, S., Pezzotti, M., Avesani, L. Comparative evaluation of recombinant protein production in different biofactories: The green perspective. BioMed Research International. , (2014).
- Menkhaus, T. J., Bai, Y., Zhang, C., Nikolov, Z. L., Glatz, C. E. Considerations for the recovery of recombinant proteins from plants. Biotechnology Progress. 20 (4), 1001-1014 (2004).
- Avesani, L., Bortesi, L., Santi, L., Falorni, A., Pezzotti, M. Plant-made pharmaceuticals for the prevention and treatment of autoimmune diseases: Where are we?. Expert Review of Vaccines. 9 (8), 957 (2010).
- Marillonnet, S., Thoeringer, C., Kandzia, R., Klimyuk, V., Gleba, Y. Systemic Agrobacterium tumefaciens-mediated transfection of viral replicons for efficient transient expression in plants. Nature Biotechnology. 23, (2005).
- Ludvigsson, J. Update on treatment of type 1 diabetes in childhood. Current Pediatric Reviews. 1 (2), 118-127 (2013).
- Merlin, M., et al. Enhanced GAD65 production in plants using the MagnICON transient expression system: Optimization of upstream production and downstream processing. Biotechnology Journal. 11 (4), 542-553 (2016).
- Gecchele, E., Merlin, M., Brozzetti, A., Falorni, A., Pezzotti, M., Avesani, L. A Comparative Analysis of Recombinant Protein Expression in Different Biofactories: Bacteria, Insect Cells and Plant Systems. Journal of Visualized Experiments. 23 (97), (2015).
- Dal Santo, S., et al. The terroir concept interpreted through grape berry metabolomics and transcriptomics. Journal of Visualized Experiments. 5 (116), (2016).
- Chen, Q., et al. Agroinfiltration as an effective and scalable strategy of gene delivery for production of pharmaceutical proteins. Advanced Techniques in Biology and Medicine. 1 (1), (2013).
- Bertini, E., et al. Design of a type-1 diabetes vaccine candidate using edible plants expressing a major autoantigen. Frontiers in Plant Science. 9, (2018).
- Avesani, L., et al. Improved in planta expression of the human islet autoantigen glutamic acid decarboxylase (GAD65). Transgenic Research. 12 (2), 203-212 (2003).
- Sepúlveda-Jiménez, G., Rueda-Benítez, P., Porta, H., Rocha-Sosa, M. A red beet (Beta vulgaris) UDP-glucosyltransferase gene induced by wounding, bacterial infiltration and oxidative stress. Journal of Experimental Botany. 56, (2005).
- Renukuntla, J., Vadlapudi, A. D., Patel, A., Boddu, S. H. S., Mitra, A. Approaches for enhancing oral bioavailability of peptides and proteins. International Journal of Pharmaceutics. 447, 75-93 (2013).
- . Encapsulation importance in pharmaceutical area, how it is done and issues about herbal extraction Available from: https://www.researchgate.net/publication/271702091_Encapsulation_importance_in_pharmaceutical_area_how_it_is_done_and_issues_about_herbal_extraction (2015)
- Kamei, N., et al. Complexation hydrogels for intestinal delivery of interferon beta and calcitonin. Journal of Controlled Release. 134, 98-102 (2009).
- Tuesca, A., et al. Complexation hydrogels for oral insulin delivery: effects of polymer dosing on in vivo efficacy. Journal of Pharmaceutical Sciences. 97, 2607-2618 (2008).
- Twyman, R. M., Schillberg, S., Fischer, R. Optimizing the yield of recombinant pharmaceutical proteins in plants. Current Pharmaceutical Design. 19, 5486-5494 (2013).
- Dhama, K., et al. Plant-based oral vaccines for human and animal pathogens – a new era of prophylaxis: current and future perspectives. Journal of Experimental Biology and Agricultural Sciences. 447, 75-93 (2013).
- Hefferon, K. Reconceptualizing cancer immunotherapy based on plant production systems. Future science. O3, (2017).
