Transiente Expression in rote Beete einen biopharmazeutischen Kandidat Impfstoff für Typ-1-Diabetes

Summary

Hier präsentieren wir ein Protokoll, um eine mündliche Impfstoffkandidaten gegen Diabetes Typ1 in eine essbare Pflanze produzieren.

Abstract

Pflanze molekulare Landwirtschaft ist der Einsatz von Anlagen zur Erzeugung von Molekülen von Interesse. Unter diesem Gesichtspunkt können Pflanzen sowohl als Bioreaktoren für die Produktion und die anschliessende Reinigung des Endprodukts und für die direkte mündliche Übergabe heterologen Proteine verwendet werden, wenn essbare Pflanzenarten zu verwenden. In dieser Arbeit präsentieren wir die Entwicklung von einem Kandidaten Schluckimpfung gegen Typ-1-Diabetes (T1D) in essbare Anlagensysteme mit dekonstruierten Pflanze Virus-basierte rekombinanter DNA-Technologie, geliefert mit Vakuum Infiltration. Unsere Ergebnisse zeigen, dass eine rote Beete geeignet Host für die transiente Expression von einem menschlichen abgeleiteten Autoantigen T1D, als ein viel versprechender Kandidat als T1D Impfstoff zugeordnet ist. Blätter produzieren die Autoantigen zeichneten sich gründlich auf ihre Resistenz gegen Magen Verdauung und für das Vorhandensein der bakteriellen Restladung ihre sekundäre metabolischen Profils, geben einen Überblick über die Prozess-Produktion für den möglichen Einsatz von Anlagen zur mündlichen Direktlieferung von einer heterologen Proteinen. Unsere Analyse ergab fast vollständigen Abbau der gefriergetrockneten Kandidat Schluckimpfung nach einer simulierten Magen Verdauung, was darauf hindeutet, dass eine Kapselung-Strategie bei der Herstellung von pflanzlichen GAD Impfstoff erforderlich ist.

Introduction

Seit der Pflanze Molekularbiologie Revolution in den 1980er Jahren können als Alternative zu herkömmlichen Systemen basierend auf mikrobielle und Säugetier-Zellen¹pflanzliche Systeme für die Produktion von Biopharmazeutika betrachtet werden. Pflanzen zeigen mehrere Vorteile gegenüber herkömmlichen Plattformen mit Skalierbarkeit, Wirtschaftlichkeit und Sicherheit werden die relevantesten². Das rekombinante Produkt kann von transformierte Pflanzengewebe gereinigt und dann verabreicht, entweder parenteral oder oral und darüber hinaus kann transformierten essbare Pflanze direkt zur mündlichen Lieferung verwendet werden. Die orale Verabreichung fördert gleichzeitig Schleimhaut und systemische Immunität, und es entfällt die Notwendigkeit für Nadeln und medizinisches Fachpersonal. Darüber hinaus entfällt mündlichen Lieferung die komplexe Weiterverarbeitung, die normalerweise 80 % der gesamten Herstellungskosten eines rekombinanten Proteins³ausmacht. Diese Vorteile können übersetzt werden Einsparungen in der Produktion, Versorgung und Arbeit, die Reduzierung der Kosten für jede Dosis, das Medikament zu einem Großteil der Weltbevölkerung erschwinglich zu machen.

Für die Produktion rekombinanter Proteine in Pflanzen wurden mehrere Strategien, sowohl für stabile Transformation und transiente Expression entwickelt. Unter anderem bietet eine hochverzinsliche dekonstruiert Virus-basierte Ausdruck der Anlage (z. B. MagnICON) überlegenen Leistung, hohe Erträge von rekombinanten Proteinen über relativ kurze Fristen⁴führt. Viele Beispiele für transiente Expression mit der Virus-basierte Ausdruck der Anlage in Nicotiana Benthamiana Pflanzen werden gemeldet und den Gold-Standard-Produktions-Server. Allerdings gilt diese Modellpflanze nicht als essbaren Arten aufgrund der Alkaloide und andere toxischen Metaboliten, die in den Blättern angesammelt werden.

In dieser Arbeit beschreiben wir den Vergleich zwischen zwei essbare Anlagensysteme, rote Beete (Beta Vulgaris cv Moulin Rouge) und Spinat (Spinacea Oleracea cv Industria), für den Ausdruck von zwei Kandidaten der 65 kDa Isoform von Glutaminsäure Decarboxylase (GAD65), durchgeführt von der Pflanze, die Virus-basierte Vektoren⁵. GAD65 ist eine große Autoantigen, Typ 1 Diabetes (T1D) zugeordnet und es wird derzeit in klinischen Studien am Menschen zu verhindern oder zu verzögern T1D durch Induktion Toleranz⁶untersucht. Die Produktion von GAD65 in Pflanzen wurde ausgiebig im Modell Pflanzenarten wie Nicotiana Tabacum und N. Benthamiana^4,5,6,7untersucht. Hier beschreiben wir die Verwendung von essbaren Pflanzen für die Herstellung des Moleküls in Geweben, die für eine mündliche Direktfahrt gemeint sein kann. Aus technischer Sicht wir studierten und das System für die Pflanze Agroinfiltration und essbare Pflanze Plattform für GAD65 Produktion durch die Auswertung verschiedener Parameter ausgewählt: die rekombinante Proteinexpression Ebenen, die mikrobielle Restladung im Werk Gewebe für die mündlichen Lieferung, den Widerstand der GAD65, der Magen Verdauung und die Bioäquivalenz der transformierten Pflanzen mit dem Wildtyp.

Protocol

1. rote Rüben und Spinat Anbau Rote Beete wachsen (B. Vulgaris cv Moulin Rouge) und Spinat (S. Oleracea cv Industria) Pflanzen in einer Kammer Wachstum mit 150 µE Lichtintensität, 65 % Relative Luftfeuchtigkeit, 12 h hell/dunkel-Zyklus am 23/21 ° C, beziehungsweise. Nach der Keimung der Samen Düngen der Pflanzen zweimal wöchentlich mit einer Lösung von 1 g/L von einem handelsüblichen Dünger (Table of Materials). Verwenden Sie für Agroinfiltration fünf Woch…

Representative Results

In dieser Arbeit wird der Workflow für die Entwicklung einer Schluckimpfung in essbare Pflanzengeweben vorgestellt. Der Schwerpunkt dieser Arbeit ist der Ausdruck ein Zielprotein in einer essbaren Host Pflanzenarten und die Charakterisierung der potenziellen Schluckimpfung. Der erste Schritt bestand die Bewertung der Eignung von Virus-basierte Ausdruck Anlagentechnik, rekombinante Proteine in essbare Anlagen zu produzieren. Zu …

Discussion

In dieser Studie haben wir vorläufige Analyse für die Gestaltung der ein Kandidat Schluckimpfung für autoimmune Diabetes gezeigt. Das Zielprotein für dieses Experiment war eine mutierte Form des menschlichen 65 kDa Glutamat-Decarboxylase, welche Produktion und Funktionalität sind leicht nachweisbar und messbar¹². Ihren Ausdruck in verschiedenen essbaren Pflanzengeweben wurde durch die Vektoren⁵, vermittelt die vermitteln eines hohen Maß an rekombinanten Proteinprodukt…

Materials

0.2-μm Minisart RC4 membrane filters	Sartorius-Stedim	17764
2–mercaptoethanol	Sigma	M3148	Toxic; 4 % to make loading buffer with glycerol, SDS and Tris-HCl
4-Morpholineethanesulfonic acid (MES)	Sigma	M8250	pH 5.5
96-well plate	Sarstedt	833924
Acetic acid	Sigma	27221	Corrosive
Acetonitrile LC-MS grade	Sigma	34967
Acetosyringone	Sigma	D134406	Toxic – 0.1 M stock in DMSO
Agar Bacteriological Grade	Applichem	A0949	15 g/L to make LB medium (pH 7.5 with NaOH) with Yeast extract, NaCl and Tryptone
Ammonium formate	Sigma	70221
Anti-eGFP antibody	ABCam	ab290
Anti-GAD 65/67 antibody	Sigma	G5163
Anti-LHCB2 antibody	Agrisera	AS01 003
Brilliant Blue R-250	Sigma	B7920
C18 Column	Grace	–	Alltima HP C18 (150 mm x 2.1 mm; 3 μm) Column
C18 Guard Column	Grace	–	Alltima HP C18 (7.5 mm x 2.1 mm; 5 μm) Guard  Column
CalMag Grower	Peter Excel	15-5-15	Fertilizer
Carbenicillin disodium	Duchefa Biochemie	C0109	Toxic
Chemiluminescence imaging system	BioRad	1708370	ChemiDoc Touch Imaging System
Chloroform	Sigma	C2432
Detergent	Sigma	P5927	Polysorbate 20
Fluorescence reader	Perkin-Elmer	1420-011	VICTOR Multilabel Counter
Formic acid LC-MS grade	Sigma	94318
Glycerol	Sigma	G5516	15 % to make loading buffer with Tris-HCl, SDS and 2–mercaptoethanol
GoTaq G2 polymerase	Promega	M7841
HCl	Sigma	H1758	Corrosive
HILIC Column	Grace	–	Ascentis Express HILIC (150 mm x 2.1 mm; particles size 2.7 μm) Column
HILIC Guard Column	Grace	–	Vision HT HILIC (7.5 mm x 2.1 mm; 3 μm) Guard  Column
Horseradish peroxidase (HRP)-conjugate anti-rabbit antibody	Sigma	A6154	Do not freeze/thaw too many times
HPLC Autosampler	Beckman Coulter	–	System Gold 508 Autosampler
HPLC System	Beckman Coulter	–	System Gold 128 Solvent Module HPLC
Isopropanol	Sigma	24137	Flamable
Kanamycin sulfate	Sigma	K4000	Toxic
KCl	Sigma	P9541	2 g/L with NaCl , Na2HPO4 and KH2PO4 to make PBS
KH2PO4	Sigma	P9791	2.4 g/L with NaCl , Na2HPO4 and KCl to make PBS
Loading Buffer
Luminol solution	Ge Healthcare	RPN2232	Prepare the solution using the ECL Prime Western Blotting System commercial kit
Lyophilizator	5Pascal	LIO5P0000DGT
Mass Spectometer	Bruker Daltonics	–	Bruker Esquire 6000; the mass spectrometer was equipped with an ESI source and the analyzer was an ion trap
Methanol	Sigma	32213
MgSO4	Sigma	M7506
Milk-blocking solution	Ristora	–	3 % in PBS
Na2HPO4	Sigma	S7907	Use with NaH2PO4 to make Sodium Phospate buffer
NaCl	Sigma	S3014	80 g/L with KCl, Na2HPO4 and KH2PO4 to make PBS; 10 g/L to make LB medium (pH 7.5 with NaOH) with Yeast extract, Tryptone and Agar Bacteriological Grade
NaH2PO4	Sigma	S8282	Use with Na2HPO4 to make Sodium Phospate buffer; 14.4 g/L to make PBS
NaOH	Sigma	S8045
Nitrocellulase membrane	Ge Healthcare	10600002
Pepsin from porcine gastric mucosa	Sigma	P7000
Peroxidase substrate ECL	GE Healthcare	RPN2235	Light sensitive material
Pump Vacuum Press	VWR	111400000098
Reagent A	Sigma	B9643	Use 50 parts of this reagent with 1 part of reagent B to prepare BCA working solution
Reagent B	Sigma	B9643	Use 1 part of this reagent with 50 parts of reagent A to prepare BCA working solution
Rifampicin	Duchefa Biochemie	R0146	Toxic – 25 mg/mL stock in DMSO
SDS (Sodium dodecyl sulphate)	Sigma	L3771	Flamable, toxic, corrosive-10 % stock; 3 % to make loading buffer with Tris-HCl, Glycerol and 2–mercaptoethanol
Sodium metabisulphite	Sigma	7681-57-4
Sonicator system	Soltec	090.003.0003	Sonica® 2200 MH; frequency 40 khz
Syringe	Terumo	–
Transparent fixed 300-µL insert glass tubes	Thermo Scientific	11573680
Trizma Base	Sigma	T1503	Adjust pH with 1N HCl to make Tris-HCl buffer, use 1,5M Tris-HCl (pH 6.8) to make loading buffer with SDS, Glycerol and 2–mercaptoethanol
Tryptone	Formedium	TRP03	10 g/L to make LB medium (pH 7.5 with NaOH) with Yeast extract, NaCl and Agar Bacteriological Grade
Vacuum concentrator	Heto	3878 F1-3	Speed-vac System
Water LC-MS grade	Sigma	39253
Yeast extract	Sigma	Y1333	5 g/L to make LB medium (pH 7.5 with NaOH) with Tryptone, NaCl and Agar Bacteriological Grade