केनोहैबडाइटिस एलिगेंस में माइटिस समूह स्ट्रेप्टोकोक्की के कारण ऑक्सीडेटिव तनाव का अध्ययन
Summary
सूत्रकृमि केनोहैबडाइटिस एलिगेंस मेजबान-रोगज़नक़ सहभागिताओं को विभाजित करने के लिए एक उत्कृष्ट मॉडल है । यहां वर्णित एक प्रोटोकॉल के लिए mitis समूह स्ट्रेप्टोकोक्की के सदस्यों के साथ कृमि संक्रमित और एच2ओ2 के खिलाफ oxidative तनाव प्रतिक्रिया के सक्रियण का निर्धारण जीवों के इस समूह द्वारा उत्पादित है ।
Abstract
एक मुक्त रहने वाला सूत्रकृमि, केनोहैबडिटिस एलिगेंस (C. एलिगेंस), होस्ट-रोगज़नक़ इंटरैक्शन का अध्ययन करने के लिए एक आकर्षक मॉडल के रूप में उभरा है । प्रस्तुत प्रोटोकॉल इस मॉडल का उपयोग करता है के लिए एच2ओ2के उत्पादन के माध्यम से mitis समूह स्ट्रेप्टोकोक्की की वजह से रोगजनन का निर्धारण । मिटिस समूह स्ट्रेप्टोकोक्की एक उभरते खतरा है कि इस तरह के जीवाणु, एंडोकार्डिटिस, और कक्षीय सेलुलाइटिस के रूप में कई मानव रोगों का कारण रहे हैं । यहां वर्णित एक प्रोटोकॉल के लिए एच2ओ2 के जवाब में इन कीड़ों के अस्तित्व का निर्धारण करने के लिए रोगजनकों के इस समूह द्वारा उत्पादित है । जीन skn-1 एक oxidative तनाव प्रतिक्रिया ट्रांसक्रिप्शन फैक्टर के लिए एंकोडिंग का उपयोग करना, यह दिखाया गया है कि इस मॉडल को मेजबान जीन है कि स्ट्रेप्टोकोकल संक्रमण के खिलाफ आवश्यक है की पहचान के लिए महत्वपूर्ण है । इसके अलावा, यह दिखाया गया है कि oxidative तनाव प्रतिक्रिया के सक्रियण इन रोगाणुओं की उपस्थिति में एक ट्रांसजेनिक रिपोर्टर कृमि तनाव का उपयोग कर निगरानी की जा सकती है, जिसमें SKN-1 ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) के लिए किया जाता है । इन assays के लिए oxidative तनाव प्रतिक्रिया का अध्ययन करने का अवसर प्रदान करने के लिए एच2ओ2 एक जैविक स्रोत द्वारा व्युत्पंन के रूप में exogenously प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (ROS) स्रोतों से जोड़ा ।
Introduction
मिटिस समूह स्ट्रेप्टोकोक्की oropharyngeal गुहा1के मानव commensals हैं । हालांकि, इन जीवों इस जगह से बच सकते है और आक्रामक2रोगों की एक किस्म का कारण । इन सूक्ष्मजीवों के कारण संक्रमण जीवाणुता, एंडोकार्डिटिस, और कक्षीय सेलुलाइटिस2,3,4,5,6शामिल हैं । इसके अलावा, वे immunocompromised में खून संक्रमण के प्रेरणा एजेंटों के रूप में उभर रहे हैं, neutropenic, और कैंसर रोगियों कि रसायन चिकित्सा5,7,8,9 आया है .
मेकेनिज्म समूह रोगजनन अंतर्निहित तंत्र अस्पष्ट है, क्योंकि कुछ विउलेंस कारकों की पहचान की गई है । mitis समूह एच2ओ2, जो मौखिक माइक्रोबियल समुदायों में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाने के लिए दिखाया गया है उत्पादन के लिए जाना जाता है10. हाल ही में, कई अध्ययनों एच2ओ2 के लिए एक भूमिका पर प्रकाश डाला है के रूप में एक cytoटॉक्सिन कि उपकला सेल मौत11,12लाती । एस निमोनिया, जो इस समूह के अंतर्गत आता है, एच2ओ2 के उच्च स्तर का उत्पादन करने के लिए दिखाया गया है कि एल्वियोलर कोशिकाओं में डीएनए क्षति और apoptosis को प्रेरित करता है13. एक तीव्र निमोनिया जानवर मॉडल का उपयोग कर, एक ही शोधकर्ताओं ने प्रदर्शन किया है कि एच2ओ2 के उत्पादन बैक्टीरिया एक डाह लाभ प्रदान करता है । न्यूमोकोकल मेनिनजाइटिस पर अध्ययन से यह भी पता चला है कि रोगज़नक़-एच2ओ2 के साथ synergistically न्यूरोनल सेल मौत14ट्रिगर करने के लिए निमोनिया । इन टिप्पणियों स्पष्ट रूप से स्थापित है कि एच2ओ बैक्टीरिया के इस समूह द्वारा उत्पादित2 उनके रोगजनन के लिए महत्वपूर्ण है ।
मजे की बात यह भी है कि मितिस ग्रुप के एस मिटिस और एस ओरालिस के सदस्यों ने एच2ओ215,16के उत्पादन के माध्यम से सूत्रकृमि सी. एलिगेंस की मृत्यु का कारण दर्शाया है । यह मुक्त रहने वाले सूत्रकृमि कई जैविक प्रक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए एक सरल, आनुवंशिक रूप से सुविधाजनक मॉडल के रूप में इस्तेमाल किया गया है । हाल ही में, कीड़ा एक मॉडल के रूप में उभरा है मेजबान के अध्ययन-रोगज़नक़17,18। इसके अलावा, कई अध्ययनों से इस जीव19,20,21का उपयोग कर oxidative तनाव का अध्ययन के महत्व को उजागर किया है । इसके लघु जीवन चक्र, RNAi द्वारा ब्याज की जीन पछाडाडाउन करने की क्षमता, और हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन का उपयोग (GFP)-fused के लिए जीन अभिव्यक्ति की निगरानी के लिए संवाददाताओं विशेषताओं है कि यह एक आकर्षक मॉडल प्रणाली बनाने के कुछ कर रहे हैं । इससे भी महत्वपूर्ण बात, मार्ग है कि oxidative तनाव और कृमि में जंमजात प्रतिरक्षा को विनियमित उच्च स्तनधारियों के साथ20,22का संरक्षण कर रहे हैं ।
इस प्रोटोकाल में यह दर्शाया गया है कि स्ट्रेप्टोकॉकल-व्युत्पन्न एच2ओ2के कारण होने वाली रोगजनन को स्पष्ट करने के लिए सी. एलिगेंस का उपयोग कैसे करें । एक संशोधित अस्तित्व परख दिखाया गया है, और mitis समूह के सदस्यों को तेजी से कीड़े को मारने के लिए एच2ओ2के उत्पादन के माध्यम से कर रहे हैं । माइटिस समूह के सदस्यों का उपयोग, प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (आरओज) के एक निरंतर जैविक स्रोत प्रदान की जाती है, के रूप में रासायनिक स्रोतों कि कीड़े में oxidative तनाव पैदा करने के लिए विरोध किया । इसके अलावा, बैक्टीरिया कीड़े तेजी से उपनिवेशित करने में सक्षम हैं, जो एच2ओ2 के लिए अनुमति देता है सीधे आंतों की कोशिकाओं को लक्षित करने के लिए (अन्य स्रोतों है कि कई बाधाओं को पार करने की तुलना में). परख या तो 1) skn-1 उत्परिवर्ती तनाव या 2 के अस्तित्व का निर्धारण द्वारा मांय है) नीचे दस्तक द्वारा skn-1 के कीड़े में Rnai का उपयोग कर N2 जंगली प्रकार और वेक्टर नियंत्रण कीड़े का इलाज किया । skn-1 एक महत्वपूर्ण ट्रांसक्रिप्शन कारक है जो C. एलिगेंस23,24,25में oxidative तनाव प्रतिक्रिया को नियंत्रित करता है । अस्तित्व assays के अलावा, एक कीड़ा तनाव एक SKN-1B/C:: GFP ट्रांसजेनिक रिपोर्टर को mitis समूह द्वारा एच2ओ2 के उत्पादन के माध्यम से oxidative तनाव प्रतिक्रिया के सक्रियण की निगरानी करने के लिए प्रयोग किया जाता है ।
Protocol
Representative Results
Discussion
वर्णित तरीकों एंटेरोकोकस faeciumके रूप में अंय रोगजनक बैक्टीरिया के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, जो भी एच2ओ2 अवायवीय या microaerophilic शर्तों26के तहत हो उत्पादन । आमतौर पर, सबसे रोगजनक जीवों के ल?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम डॉ बिंग-यान वांग, डॉ Gena Tribble धंयवाद (टेक्सास विश्वविद्यालय, दंत चिकित्सा के स्कूल), डॉ रिचर्ड Lamont विश्वविद्यालय (Louisville, दंत चिकित्सा के स्कूल), और Dr. शमूएल शेलब्रने (एमडी एंडरसन कैंसर केंद्र) के लिए प्रयोगशाला और नैदानिक उपभेदों प्रदान करने के लिए मिटिस समूह स्ट्रेप्टोकोक्की । C. एलिगेंस उपभेदों के लिए हम भी डॉ कीथ ब्लैकवेल (आनुवंशिकी विभाग, हार्वर्ड मेडिकल स्कूल) का शुक्र है । अंत में, हम डॉ डेनिएल Garsin और उसकी प्रयोगशाला धंयवाद (टेक्सास विश्वविद्यालय, McGovern मेडिकल स्कूल) अभिकर्मकों और कृमि उपभेदों प्रदान करने के लिए अध्ययन का संचालन । कुछ कृमि उपभेदों CGC, जो अनुसंधान अवसंरचना कार्यक्रम (P40 OD010440) के NIH कार्यालय द्वारा वित्त पोषित है द्वारा प्रदान की गई ।
Materials
| Media and chemicals | |||
| Agarose | Sigma Aldrich | A9539-50G | |
| Bacto peptone | Fisher Scientific | DF0118-17-0 | |
| BD Bacto Todd Hewitt Broth | Fisher Scientific | DF0492-17-6 | |
| BD BBL Sheep Blood, Defibrinated | Fisher Scientific | B11947 | |
| BD Difco Agar | Fisher Scientific | DF0145-17-0 | |
| BD Difco LB Broth | Fisher Scientific | DF0446-17-3 | |
| Blood agar (TSA with Sheep Blood) | Fisher Scientific | R01200 | |
| Calcium Chloride | Fisher Scientific | BP510-500 | |
| Carbenicillin | Fisher Scientific | BP26481 | |
| Catalase | Sigma Aldrich | C1345-1G | |
| Cholesterol | Fisher Scientific | ICN10138201 | |
| IPTG | Fisher Scientific | MP21021012 | |
| Magnesium sulfate | Fisher Scientific | BP213-1 | |
| Nystatin | Acros organics | AC455500050 | |
| Potassium Phosphate Dibasic | Fisher Scientific | BP363-500 | |
| Potassium phosphate monobasic | Fisher Scientific | BP362-500 | |
| Sodium Azide | Sigma Aldrich | S2002-25G | |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | BP358-1 | |
| Sodium Hydroxide | Fisher Scientific | SS266-1 | |
| 8.25% Sodium Hypochlorite | |||
| Sodium Phosphate Dibasic | Fisher Scientific | BP332-500 | |
| Streptomycin Sulfate | Fisher Scientific | BP910-50 | |
| Tetracyclin | Sigma Aldrich | 87128-25G | |
| (−)-Tetramisole hydrochloride | Sigma Aldrich | L9756 | |
| Yeast extract | Fisher Scientific | BP1422-500 | |
| Consumables | |||
| 15mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 12-565-269 | |
| Disposable Polystyrene Serological Pipettes 10mL | Fisher Scientific | 07-200-574 | |
| Disposable Polystyrene Serological Pipettes 25mL | Fisher Scientific | 07-200-575 | |
| Falcon Bacteriological Petri Dishes with Lid (35 x 10 mm) | Fisher Scientific | 08-757-100A | |
| No. 1.5 18 mm X 18 mm Cover Slips | Fisher Scientific | 12-541A | |
| Petri Dish with Clear Lid (60 x 15 mm) | Fisher Scientific | FB0875713A | |
| Petri Dishes with Clear Lid (100X15mm) | Fisher Scientific | FB0875712 | |
| Plain Glass Microscope Slides (75 x 25 mm) | Fisher Scientific | 12-544-4 | |
| Software | |||
| Prism | Graphpad | ||
| Bacterial Strains | |||
| S. oralis ATCC 35037 | |||
| S. mitis ATCC 49456 | |||
| S. gordonii DL1 Challis | |||
| E. coli OP50 | |||
| E. coli HT115 | |||
| Worm Strains | |||
| Strain | Genotype | Transgene | Source |
| N2 | C. elegans wild isolate | CGC | |
| EU1 | skn-1(zu67) IV/nT1 [unc-?(n754) let-?] (IV;V) | CGC | |
| LD002 | IdIs1 | SKN-1B/C::GFP + rol-6(su1006) | Keith Blackwell |
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