Studiando lo Stress ossidativo causato dagli streptococchi di gruppo Mitis in Caenorhabditis elegans
Summary
Il nematode Caenorhabditis elegans è un eccellente modello per sezionare interazioni ospite-patogeno. Un protocollo per infettare il worm con membri degli streptococchi gruppo mitis e determinare l’attivazione della risposta di sforzo ossidativo contro H2O2 prodotto da questo gruppo di organismi è descritto qui.
Abstract
Caenorhabditis elegans (c. elegans), un nematode dissipato, è emerso come un modello interessante per studiare le interazioni ospite-patogeno. Il protocollo presentato utilizza questo modello per determinare la patogenicità causata da streptococchi gruppo mitis attraverso la produzione di H2O2. Gli streptococchi di gruppo mitis sono una minaccia emergente che causano molte malattie umane quali batteriemia, endocardite e cellulite orbitale. Descritto qui è un protocollo per determinare la sopravvivenza di questi vermi in risposta a H2O2 prodotto da questo gruppo di agenti patogeni. Usando il skn-1 del gene che codifica per un fattore di trascrizione di risposta di stress ossidativo, esso è indicato che questo modello è importante per l’identificazione di geni ospitanti che sono essenziali contro l’infezione streptococcica. Inoltre è dimostrato che l’attivazione della risposta allo stress ossidativo può essere monitorato in presenza di questi patogeni utilizzando un ceppo di vite senza fine di reporter transgenici, in cui viene fuso SKN-1 proteina fluorescente verde (GFP). Queste analisi forniscono la possibilità di studiare la risposta allo stress ossidativo di H2O2 derivato da una fonte biologica rispetto a esogenicamente aggiunto fonti (ROS) di specie reattive dell’ossigeno.
Introduction
Gli streptococchi del gruppo mitis sono commensals umano della cavità orofaringea1. Tuttavia, questi organismi possono sfuggire questa nicchia e causano una serie di malattie invasive2. Le infezioni causate da questi microrganismi sono batteriemia, endocardite e cellulite orbitale2,3,4,5,6. Inoltre, essi stanno emergendo come causativi agenti di infezioni del torrente sanguigno in immunocompromessi, neutropenic e malati di cancro sottoposti a chemioterapia5,7,8,9 .
I meccanismi di patogenesi di gruppo fondo mitis è oscuro, perché sono stati identificati alcuni fattori di virulenza. Il gruppo di mitis è noto per la produzione di H2O2, che ha dimostrato di giocare un ruolo importante nella comunità microbica orale10. Più recentemente, diversi studi hanno evidenziato un ruolo per H2O2 come una citotossina che induce la morte delle cellule epiteliali11,12. Polmonite S., che appartiene a questo gruppo, ha dimostrato di produrre alti livelli di H2O2 che induce il danno del DNA e l’apoptosi in cellule alveolari13. Utilizzando un modello animale di polmonite acuta, gli stessi ricercatori hanno dimostrato che la produzione di H2O2 dai batteri conferisce un vantaggio di virulenza. Studi su meningite pneumococcal hanno inoltre dimostrato che patogeno-derivati H2O2 agisce in sinergia con pneumolysin per innescare un neurone delle cellule morte14. Queste osservazioni stabiliscono chiaramente che H2O2 prodotto da questo gruppo di batteri è importante per loro patogenicità.
È interessante notare che, esso ha anche dimostrato che gruppo del mitis mitis dello s. e s. oralis causare la morte della del nematode c. elegans attraverso la produzione di H2O215,16. Questo nematode dissipato è stato utilizzato come un modello semplice, geneticamente trattabile per studiare molti processi biologici. Più recentemente, il worm è emerso come un modello per lo studio di interazioni ospite-patogeno17,18. Inoltre, diversi studi hanno evidenziato l’importanza dello studio dello stress ossidativo tramite questo organismo19,20,21. Suo ciclo di vita breve, la capacità di atterramento geni di interesse di RNAi e l’uso della proteina fluorescente verde (GFP)-reporter fuso per monitorare l’espressione genica sono alcuni degli attributi che lo rendono un sistema modello attraente. Ancora più importante, le vie che regolano lo stress ossidativo e l’immunità innata nel verme sono altamente conservate con mammiferi20,22.
In questo protocollo, è dimostrato come utilizzare c. elegans per delucidare la patogenicità causata da streptococco-derivati H2O2. Un’analisi di sopravvivenza modificate è mostrata, e membri del gruppo mitis sono in grado di uccidere i vermi rapidamente tramite la produzione di H2O2. Utilizzando i membri del gruppo di mitis, una costante fonte biologica di specie reattive dell’ossigeno (ROS) è prevista, al contrario di fonti chimiche che inducono lo sforzo ossidativo nei vermi. Inoltre, i batteri sono in grado di colonizzare rapidamente, i vermi che permette per H2O2 essere direttamente indirizzati alle cellule intestinali (rispetto ad altre fonti che devono attraversare diverse barriere). Il dosaggio è convalidato o 1) per determinare la sopravvivenza del ceppo mutante skn-1 o 2) battendo giù skn-1 mediante RNAi in worms rispetto la N2 selvaggio-tipo e vettoriale controllo trattato worms. SKN-1 è un fattore di trascrizione importante che regola la risposta allo stress ossidativo in c. elegans23,24,25. Oltre alle analisi di sopravvivenza, un ceppo di vite senza fine che esprimono un reporter transgenico SKN-1B/C::GFP viene utilizzato per monitorare l’attivazione della stress ossidativo risposta tramite la produzione di H2O2 dal gruppo mitis.
Protocol
Representative Results
Discussion
I metodi descritti possono essere utilizzati per altri batteri patogeni quali Enterococcus faecium, che produce anche H2O2 cresciuti sotto anaerobico o microaerofili condizioni26. In genere, per più germi patogeni, ci vogliono diversi giorni per settimane per completare le analisi di sopravvivenza. Tuttavia, a causa della produzione robusta di H2O2 dai membri del gruppo di mitis, queste analisi potrebbero essere completate entro 5-6 h nelle con…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Si ringraziano il Dr. Bing-Yan Wang, Dr. Gena Tribble (The University of Texas, scuola di odontoiatria), Dr. Richard Lamont (Università di Louisville, scuola di odontoiatria) e Dr. Samuel Shelburne (MD Anderson Cancer Center) per la fornitura di laboratorio e ceppi clinici di gli streptococchi di gruppo mitis. Ringraziamo anche il dottor Keith Blackwell (dipartimento di genetica, Harvard Medical School) per i ceppi di c. elegans . Infine, ringraziamo Dr. Danielle Garsin e suo laboratorio (l’Università del Texas, McGovern Medical School) per la fornitura di reagenti e ceppi di vite senza fine per condurre lo studio. Alcuni ceppi di vite senza fine sono stati forniti da CGC, che è finanziato dall’ufficio di NIH di programmi di ricerca dell’infrastruttura (P40 OD010440).
Materials
| Media and chemicals | |||
| Agarose | Sigma Aldrich | A9539-50G | |
| Bacto peptone | Fisher Scientific | DF0118-17-0 | |
| BD Bacto Todd Hewitt Broth | Fisher Scientific | DF0492-17-6 | |
| BD BBL Sheep Blood, Defibrinated | Fisher Scientific | B11947 | |
| BD Difco Agar | Fisher Scientific | DF0145-17-0 | |
| BD Difco LB Broth | Fisher Scientific | DF0446-17-3 | |
| Blood agar (TSA with Sheep Blood) | Fisher Scientific | R01200 | |
| Calcium Chloride | Fisher Scientific | BP510-500 | |
| Carbenicillin | Fisher Scientific | BP26481 | |
| Catalase | Sigma Aldrich | C1345-1G | |
| Cholesterol | Fisher Scientific | ICN10138201 | |
| IPTG | Fisher Scientific | MP21021012 | |
| Magnesium sulfate | Fisher Scientific | BP213-1 | |
| Nystatin | Acros organics | AC455500050 | |
| Potassium Phosphate Dibasic | Fisher Scientific | BP363-500 | |
| Potassium phosphate monobasic | Fisher Scientific | BP362-500 | |
| Sodium Azide | Sigma Aldrich | S2002-25G | |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | BP358-1 | |
| Sodium Hydroxide | Fisher Scientific | SS266-1 | |
| 8.25% Sodium Hypochlorite | |||
| Sodium Phosphate Dibasic | Fisher Scientific | BP332-500 | |
| Streptomycin Sulfate | Fisher Scientific | BP910-50 | |
| Tetracyclin | Sigma Aldrich | 87128-25G | |
| (−)-Tetramisole hydrochloride | Sigma Aldrich | L9756 | |
| Yeast extract | Fisher Scientific | BP1422-500 | |
| Consumables | |||
| 15mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 12-565-269 | |
| Disposable Polystyrene Serological Pipettes 10mL | Fisher Scientific | 07-200-574 | |
| Disposable Polystyrene Serological Pipettes 25mL | Fisher Scientific | 07-200-575 | |
| Falcon Bacteriological Petri Dishes with Lid (35 x 10 mm) | Fisher Scientific | 08-757-100A | |
| No. 1.5 18 mm X 18 mm Cover Slips | Fisher Scientific | 12-541A | |
| Petri Dish with Clear Lid (60 x 15 mm) | Fisher Scientific | FB0875713A | |
| Petri Dishes with Clear Lid (100X15mm) | Fisher Scientific | FB0875712 | |
| Plain Glass Microscope Slides (75 x 25 mm) | Fisher Scientific | 12-544-4 | |
| Software | |||
| Prism | Graphpad | ||
| Bacterial Strains | |||
| S. oralis ATCC 35037 | |||
| S. mitis ATCC 49456 | |||
| S. gordonii DL1 Challis | |||
| E. coli OP50 | |||
| E. coli HT115 | |||
| Worm Strains | |||
| Strain | Genotype | Transgene | Source |
| N2 | C. elegans wild isolate | CGC | |
| EU1 | skn-1(zu67) IV/nT1 [unc-?(n754) let-?] (IV;V) | CGC | |
| LD002 | IdIs1 | SKN-1B/C::GFP + rol-6(su1006) | Keith Blackwell |
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