線虫剤群連鎖球菌によって引き起こされる酸化ストレスの勉強
Summary
線虫の線虫は、宿主-病原体相互作用を分析する優れたモデルです。ここで説明した、可鍛鋳鉄群連鎖球菌のメンバーとワームに感染し、H2O2を有機体のこのグループによって生成に対する酸化ストレス応答の活性化を決定するプロトコルです。
Abstract
線虫 (C. elegans)、線虫は、ホスト病原体の相互作用を研究する魅力的なモデルとして登場しました。提案するプロトコルは、H2O2の生産を介して可鍛鋳鉄群連鎖球菌によって引き起こされる病原性を決定するため、このモデルを使用します。可鍛鋳鉄群連鎖球菌菌血症、心内膜炎、眼窩蜂巣炎など多くの疾患を引き起こす新たな脅威であります。ここで説明した H2O2への応答でこれらのワームの生存を確認するためのプロトコルが病原体のこのグループによって生成されます。酸化ストレス応答転写因子の遺伝子skn 1エンコーディングを使用して、このモデルはレンサ球菌感染に対して不可欠な宿主遺伝子を識別するために重要であることを示す.さらに、緑色蛍光タンパク質 (GFP)、SKN 1 を融合遺伝子改変レポーター ワームひずみを用いたこれらの病原体の存在下で酸化ストレス応答の活性化を監視できることを示します。これらのアッセイは、H2O2を外ではなく、生物学的ソースによって派生する酸化ストレス応答を勉強する機会が活性酸素種 (ROS) ソースを追加提供します。
Introduction
可鍛鋳鉄群連鎖球菌は、口腔咽頭腔1の人間共生生物です。ただし、これらの生物はこのニッチを脱出し、侵襲性疾患2のさまざまなを引き起こすことができます。これらの微生物によって引き起こされる感染症は、菌血症、心内膜炎、眼窩蜂巣炎2,3,4,5,6に含まれます。さらに、彼らは浮上して血流感染症の病原体としての免疫不全、好中球減少、および化学療法5,7,8,9を受けている癌患者.
可鍛鋳鉄グループの根本的な発生機序はあいまいなので、いくつかの病原因子が同定されているメカニズムです。H2O2、口腔微生物10で重要な役割を果たすことを示している可鍛鋳鉄グループが知られています。最近では、いくつかの研究は、上皮細胞の死11,12を誘導する毒素としての H2O2の役割を強調しています。このグループに属しているs. 肺炎は、DNA 損傷と肺胞細胞13でアポトーシスを誘導する H2O2の高レベルを生成する示されています。急性肺炎動物モデルを使用して、同じ研究者は、細菌によって H2O2の生産が病原性の利点を付与を示した。肺炎球菌性髄膜炎に関する研究は、その病原体由来 H2O2は神経細胞死14をトリガーするニューモリシンと相乗的行為をも示しています。これらの観察は明らかに病原性の細菌のこのグループによって生成される、H2O2が大事を確立します。
興味深いことに、それも示されている、可鍛鋳鉄のメンバー グループ化剤H2O215,16の生産を介して線虫C. elegansの死を引き起こす口腔単純性疱疹を米します。この線虫は、多くの生物学的過程を研究する、シンプルで扱いやすい遺伝子モデルとして使用されています。最近では、ワームは、宿主-病原体相互作用17,18を研究するモデルとして登場しました。さらに、いくつかの研究は、この有機体19,20,21を使用して酸化ストレスを調査する重要性を強調しています。そのライフ サイクルは短い、RNAi が興味の遺伝子をノックダウンし、緑色蛍光タンパク質 (GFP) の使用能力-融合レポーター遺伝子の発現を監視する、いくつかの魅力的なモデル システムにする属性。もっと重要なは、酸化ストレスとワームの自然免疫を調節する経路は哺乳類20,22と非常に節約されます。
このプロトコルではc. の elegansを使用してレンサ球菌由来 H2O2による病原性を解明する方法を示した。変更された生存分析が表示され、可鍛鋳鉄グループのメンバーが急速にワームを殺すことでH2O2の生産。活性酸素種の持続的な生物的源可鍛鋳鉄グループのメンバーを使用してこの (ROS) がワームで酸化ストレスを誘発する化学のソースではなく、提供されます。さらに、細菌は急速に、ワームを植民地化することができる H2O2 (いくつかの障壁を交差する必要がある他の情報源と比較して) 腸管細胞へ直接ターゲットとすることができます。アッセイは、どちらかskn 1変異株のまたは 2) N2 野生型を基準にしてワームおよびベクター駆除処理されたワームで RNAi を用いたskn 1ノックダウンの生存を決定する 1) によって検証されます。SKN 1 はc. の elegans23,24,25の酸化ストレス応答を調節する重要な転写因子です。生存の試金、以外 SKN-1 b/C::GFP 遺伝子改変レポーターを表現するワームひずみは可鍛鋳鉄グループによる活性化、酸化ストレス応答を介してH2O2の生産を監視するために使用されます。
Protocol
Representative Results
Discussion
腸球菌 faecium、また嫌気性下で栽培した H2O2を作り出すなど他の病原細菌の説明する方法を使用できるまたは微好気条件26。通常、最も病原性生物の週間生存の試金を完了するにいくつかの日が必要。ただし、H2O2可鍛鋳鉄グループのメンバーによって堅牢な生産のためこれらの試金は記載されている条件の下で 5-6 時間以内完了でした?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我々 は博士 Bing ヤン王、博士ジーナ ・ トリブル (テキサス大学、歯学部) に感謝博士リチャード ・ ラモント (ルイビル大学、歯学部), と博士サミュエル ・ シェルバーン (MD アンダーソンがんセンター) 研究室と臨床株の提供するため可鍛鋳鉄群連鎖球菌。我々 はまたc. の elegansの緊張のため博士キース ・ ブラックウェル (遺伝部、ハーバード大学医学部) を感謝します。最後に、試薬、研究を行なうワーム株を提供するため博士ダニエル ガーシン、彼女の研究室 (テキサス大学、マクガヴァン医学) をありがちましょう。いくつかのワームの系統は、CGC、研究インフラ プログラム (P40 OD010440) の NIH のオフィスによって資金が供給されるによって提供されました。
Materials
| Media and chemicals | |||
| Agarose | Sigma Aldrich | A9539-50G | |
| Bacto peptone | Fisher Scientific | DF0118-17-0 | |
| BD Bacto Todd Hewitt Broth | Fisher Scientific | DF0492-17-6 | |
| BD BBL Sheep Blood, Defibrinated | Fisher Scientific | B11947 | |
| BD Difco Agar | Fisher Scientific | DF0145-17-0 | |
| BD Difco LB Broth | Fisher Scientific | DF0446-17-3 | |
| Blood agar (TSA with Sheep Blood) | Fisher Scientific | R01200 | |
| Calcium Chloride | Fisher Scientific | BP510-500 | |
| Carbenicillin | Fisher Scientific | BP26481 | |
| Catalase | Sigma Aldrich | C1345-1G | |
| Cholesterol | Fisher Scientific | ICN10138201 | |
| IPTG | Fisher Scientific | MP21021012 | |
| Magnesium sulfate | Fisher Scientific | BP213-1 | |
| Nystatin | Acros organics | AC455500050 | |
| Potassium Phosphate Dibasic | Fisher Scientific | BP363-500 | |
| Potassium phosphate monobasic | Fisher Scientific | BP362-500 | |
| Sodium Azide | Sigma Aldrich | S2002-25G | |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | BP358-1 | |
| Sodium Hydroxide | Fisher Scientific | SS266-1 | |
| 8.25% Sodium Hypochlorite | |||
| Sodium Phosphate Dibasic | Fisher Scientific | BP332-500 | |
| Streptomycin Sulfate | Fisher Scientific | BP910-50 | |
| Tetracyclin | Sigma Aldrich | 87128-25G | |
| (−)-Tetramisole hydrochloride | Sigma Aldrich | L9756 | |
| Yeast extract | Fisher Scientific | BP1422-500 | |
| Consumables | |||
| 15mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 12-565-269 | |
| Disposable Polystyrene Serological Pipettes 10mL | Fisher Scientific | 07-200-574 | |
| Disposable Polystyrene Serological Pipettes 25mL | Fisher Scientific | 07-200-575 | |
| Falcon Bacteriological Petri Dishes with Lid (35 x 10 mm) | Fisher Scientific | 08-757-100A | |
| No. 1.5 18 mm X 18 mm Cover Slips | Fisher Scientific | 12-541A | |
| Petri Dish with Clear Lid (60 x 15 mm) | Fisher Scientific | FB0875713A | |
| Petri Dishes with Clear Lid (100X15mm) | Fisher Scientific | FB0875712 | |
| Plain Glass Microscope Slides (75 x 25 mm) | Fisher Scientific | 12-544-4 | |
| Software | |||
| Prism | Graphpad | ||
| Bacterial Strains | |||
| S. oralis ATCC 35037 | |||
| S. mitis ATCC 49456 | |||
| S. gordonii DL1 Challis | |||
| E. coli OP50 | |||
| E. coli HT115 | |||
| Worm Strains | |||
| Strain | Genotype | Transgene | Source |
| N2 | C. elegans wild isolate | CGC | |
| EU1 | skn-1(zu67) IV/nT1 [unc-?(n754) let-?] (IV;V) | CGC | |
| LD002 | IdIs1 | SKN-1B/C::GFP + rol-6(su1006) | Keith Blackwell |
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