Summary

Identificatie van Nucleollaire factoren tijdens de HIV-1-replicatie via Rev-immunoprecipitatie en massaspectrometrie

Published: June 26, 2019
doi:

Summary

Hier beschrijven we Rev immunoprecipitatie in de aanwezigheid van HIV-1 replicatie voor massaspectrometrie. De beschreven methoden kunnen worden gebruikt voor de identificatie van nucleollaire factoren die betrokken zijn bij de HIV-1-infectieuze cyclus en zijn van toepassing op andere ziekte modellen voor de karakterisering van onderbestudeerde trajecten.

Abstract

De HIV-1 infectieuze cyclus vereist virale eiwit interacties met gastheerfactoren om virale replicatie te vergemakkelijken, verpakking, en vrijlating. De infectieuze cyclus verder vereist de vorming van virale/gastheer eiwitcomplexen met HIV-1-RNA te reguleren van de splicing en het inschakelen van nucleocytoplasmorische transport. Het HIV-1 rev-eiwit bereikt de nucleaire export van HIV-1 Mrna’s door middel van multimerisatie met intronic CIS-acteer doelen-het Rev Response element (RRE). Een nucleolar lokalisatie signaal (NoLS) bestaat binnen het COOH-eindpunt van de Rev arginine-Rich motief (ARM), waardoor de accumulatie van Rev/RRE complexen in de Nucleolus. Nucleollaire factoren worden gespeculeerd ter ondersteuning van de HIV-1-infectieuze cyclus door middel van verschillende andere functies naast het bemedieren van mRNA-onafhankelijke nucleaire export en splicing. We beschrijven een immunoprecipitatie methode van wild-type (WT) Rev in vergelijking met Rev nucleolar mutaties (deletie en single-point Rev-NoLS mutaties) in de aanwezigheid van HIV-1 replicatie voor massaspectrometrie. Nucleollaire factoren die betrokken zijn bij het nucleocytoplasminezuur transport (nucleophosmin B23 en nucleolin C23), evenals cellulaire splicing factoren, verliezen interactie met Rev in de aanwezigheid van Rev-NoLS mutaties. Verschillende andere nucleollaire factoren, zoals snoRNA C/D Box 58, zijn geïdentificeerd om interactie met Rev-mutaties te verliezen, maar hun functie in de HIV-1-replicatiecyclus blijft onbekend. De hier gepresenteerde resultaten tonen het gebruik van deze aanpak voor de identificatie van virale/host-nucleollaire factoren die de HIV-1-infectieuze cyclus behouden. De begrippen die in deze benadering worden gebruikt, zijn van toepassing op andere virale en ziekte modellen die de karakterisering van onderbestudeerde trajecten vereisen.

Introduction

De Nucleolus wordt gepostuleerd als de interactie grond van verschillende cellulaire host en virale factoren die nodig zijn voor virale replicatie. De Nucleolus is een complexe structuur onderverdeeld in drie verschillende compartimenten: het fibrillar compartiment, het dichte fibrillar compartiment en het granulaire compartiment. Het HIV-1 rev-eiwit lokaliseert specifiek binnen korrelvormige compartimenten; echter, de reden voor dit lokalisatie patroon is onbekend. In aanwezigheid van éénpunts mutaties binnen de NoLS sequentie (Rev mutaties 4, 5 en 6), handhaaft Rev een nucleolar patroon en is eerder aangetoond dat het HIV-1HXB2 replicatie moet redden, maar met een verminderde efficiëntie vergeleken met WT Rev1 . Alle éénpuntmutaties zijn niet in staat om de HIV-1NL4-3 infectieuze cyclus te ondersteunen. In de aanwezigheid van meerdere éénpunts mutaties binnen de NoLS sequentie (Rev-NoLS mutaties 2 en 9), is Rev waargenomen om te dispergeren in de Nucleus en het cytoplasma en heeft het niet kunnen redden van HIV-1HXB2 replicatie1. Het doel van deze proteomica studie is het ontcijferen van nucleollaire en niet-nucleollaire cellulaire factoren die betrokken zijn bij de Rev-mediated HIV-1 infectieuze pathway. Rev immunoprecipitatie voorwaarden worden geoptimaliseerd door interactie met de nucleolar B23 fosfoproteïne, die eerder is aangetoond dat het verliezen van interactie met Rev in de aanwezigheid van nucleollaire mutaties.

Rev cellulaire factoren zijn uitgebreid bestudeerd in het verleden; Dit is echter gebeurd bij afwezigheid van virale pathogenese. Een eiwit, in het bijzonder, dat wordt gekenmerkt in deze studie door middel van Rev interactie tijdens HIV-1 replicatie is de nucleolar fosfoprotein B23-ook wel nucleophosmin (NPM), numatrin, of NO38 in amfibieën2,3, 4. B23 wordt uitgedrukt als drie isovormen (NPM1, NPM2, en NPM3)-alle leden van de nucleophosmin/nucleoplasmin nucleaire chaperonne familie5,6. De NPM1 moleculaire chaperonne functies in de juiste assemblage van nucleosomes, in de vorming van eiwitten/nucleïnezuur complexen die betrokken zijn bij chromatine hogere orde structuren7,8, en in de preventie van aggregatie en het verkeerd vouwen van doel eiwitten via een N-terminaal kern domein (residuen 1-120)9. NPM1 functionaliteit strekt zich uit tot ribosoom Genesis door het transport van preribosomale deeltjes tussen de Nucleus en cytoplasma10,11, de verwerking van preribosomale RNA in de interne getranscribeerde spacer sequentie 12,13, en het arresteren van de nucleollaire aggregatie van eiwitten tijdens de ribosomale assemblage14,15. NPM1 is betrokken bij de remming van apoptosis16 en in de stabilisatie van tumor suppressors ARF17,18 en p5319, onthullen zijn dubbele rol als een oncogene factor en tumor suppressor. NPM1 neemt deel aan de cellulaire activiteiten van genoom stabiliteit, centrosoom replicatie, en transcriptie. NPM1 is gevonden in nucleoli tijdens celcyclus Interphase, langs de chromosomale periferie tijdens mitose, en in prenucleolar lichamen (PNB) aan het einde van de mitose. NPM2 en NPM3 zijn niet zo goed bestudeerd als NPM1, die ondergaat veranderde expressieniveaus tijdens maligniteiten20.

NPM1 is gedocumenteerd in de nucleocytoplasmische pendelen van verschillende nucleaire/nucleollaire eiwitten via een interne NES en nls9,21 en werd eerder gerapporteerd aan de nucleaire import van HIV-1 tat en Rev eiwitten rijden. In aanwezigheid van B23-bindende-Domain-β-galactosidase fusie eiwitten, TAT mislocaliseert binnen het cytoplasma en verliest trans activatie activiteit; Dit toont een sterke affiniteit van TAT voor B232. Een andere studie vestigde een Rev/B23 stabiel complex in de afwezigheid van RRE-bevattende Mrna’s. In aanwezigheid van RRE mRNA, Rev dissocieert van B23 en bindt bij voorkeur aan de HIV RRE, wat leidt tot de verplaatsing van B2322. Het is niet bekend waar, op het subnucleaire niveau, TAT trans activatie en de Rev Exchange process van B23 voor HIV mRNA plaatsvinden. Beide eiwitten zijn gepostuleerd om gelijktijdig via B23-interactie de Nucleolus binnen te gaan. De betrokkenheid van andere cellulaire eiwitten van de host in de HIV-nucleollaire pathway wordt verwacht. De in dit Proteomica-onderzoek beschreven methoden zullen helpen om het samenspel van de Nucleolus met gastheer cellulaire factoren die betrokken zijn bij HIV-1-pathogenese te verhelden.

Het Proteomica onderzoek werd geïnitieerd door de uitdrukking van Rev nols single-point mutaties (M4, M5 en M6) en meerdere arginine substituties (m2 en M9) voor HIV-1HXB2 productie. In dit model is een HeLa-cellijn dat stabiel de Rev-deficiënte HIV-1HXB2 (hlfb) UITDRUKT met WT rev en Rev nucleolar mutaties met een flag tag op het 3 ‘ einde. De aanwezigheid van WT Rev zorgt ervoor dat virale replicatie plaatsvindt in de HLfB-cultuur, in vergelijking met Rev-NoLS-mutaties die geen Rev-deficiëntie (m2 en M9) redden, of toestaan dat virale replicatie plaatsvindt, maar niet zo efficiënt als WT Rev (M4, M5 en M6)1. Het celllysaat wordt 48 h later verzameld na virale proliferatie in aanwezigheid van Rev expressie en onderworpen aan immunoprecipitatie met een lysisbuffer geoptimaliseerd voor rev/B23 interactie. Lysis buffer optimalisatie met behulp van variërende zoutconcentraties wordt beschreven, en eiwit elutie methoden voor HIV-1 rev worden vergeleken en geanalyseerd in zilver gebeitst of Coomassie-gekleurd SDS-PAGE gels. De eerste proteomica-benadering omvat de directe analyse van een geeluteerde steekproef van geuite WT Rev, m2, M6 en M9 door massaspectrometrie met tandem. Een tweede benadering waarbij de eluaten van WT Rev, M4, M5 en M6 een gel-extractieproces onderging, wordt vergeleken met de eerste benadering. Peptide affiniteit met Rev-NoLS mutaties in vergelijking met WT Rev wordt geanalyseerd en de eiwit identificatie waarschijnlijkheid weergegeven. Deze benaderingen onthullen mogelijke factoren (nucleolar en nonnucleolar) die deelnemen aan HIV-1 mRNA transport en splicing met Rev tijdens HIV-1 replicatie. In het algemeen zijn de beschreven cellysis, IP-en elutie-omstandigheden van toepassing op virale eiwitten die van belang zijn voor het begrijpen van cellulaire factoren van de host die infectieuze trajecten activeren en reguleren. Dit is ook van toepassing op de studie van cellulaire gastheerfactoren die nodig zijn voor de persistentie van verschillende ziekte modellen. In dit proteomica-model is HIV-1 rev-IP geoptimaliseerd voor B23-interactie om nucleollaire factoren te verhelden die betrokken zijn bij nucleocytoplasmorische pendelen activiteit en HIV-1 mRNA-binding. Bovendien kunnen cellijnen die stabiel zijn voor infectieuze ziekte modellen die een tekort hebben aan belangrijke eiwitten van belang, worden ontwikkeld, vergelijkbaar met de HLfB-cellijn, om infectieuze trajecten van belang te bestuderen.

Protocol

1. celcultuur Handhaaf hlfb in het gemodificeerde eagle’s medium (DMEM) van Dulbecco aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS), 2 mm L-glutamine en 1 mm natrium pyruvaat binnen met weefselcultuur behandelde 100 mm platen. Houd de celculturen bij 37 °C in een bevoficeerde incubator die wordt geleverd met 5% CO2. Passage confluente cellen naar een celdichtheid van 1 x 106 cellen/ml. Gooi de celkweek media weg. Spoel de cellen voorzichtig af met 10 mL 1x fosfaat-gebufferde zoutop…

Representative Results

Rev-NoLS single-en multiple-Point arginine mutaties, overeenkomend met een verscheidenheid van subcellulaire lokalisatie patronen, werden onderzocht in hun vermogen om te communiceren met cellulaire host factoren in vergelijking met WT Rev. WT Rev-3’vlag en pcDNA-Flag vector werden uitgedrukt in de HLfB-cultuur. Eiwitcomplexen werden verwerkt uit het totale cellysaat en gekleurd met Zilvervlek reagens. Rev-NoLS-3’flag is detecteerbaar (ongeveer 18 kDa) in drie verschillende lysisbuffer condities met verschillend…

Discussion

Massaspectrometrische analyses met vergelijking van Rev-NoLS-mutaties en WT Rev in de aanwezigheid van HIV-1 werden beoordeeld om te begrijpen welke nucleollaire factoren betrokken waren bij de virale replicatiecyclus. Dit zou nucleollaire componenten identificeren die nodig zijn voor virale infectiviteit. Nucleollaire B23 heeft een hoge affiniteit met Rev-NoLS en functies in de nucleollaire lokalisatie van Rev3 en nucleocytoplasmorische transport van Rev-gebonden HIV mRNAs22</su…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

De auteurs erkennen Dr. Barbara K. Felber en Dr. George N. PAVLAKIS voor de HLfB-aanhankelijke cultuur van de National Institutes of Health (NIH) AIDS onderzoek en referentie-reagens programma, afdeling AIDS, Nationaal Instituut voor allergie en infectieuze Ziekten (NIAID), NIH. De auteurs erkennen ook financiële bronnen verstrekt door de NIH, Grants AI042552 en AI029329.

Materials

Acetic acid Fisher Chemical A38S-212
Acetonitrile Fisher Chemical A955-500
Acrylamide:Bisacrylamide BioRad 1610158
Ammonium bicarbonate Fisher Chemical A643-500
Ammonium persulfate Sigma-Aldrich 7727-54-0
ANTI-Flag M2 affinity gel Sigma-Aldrich A2220
anti-Flag M2 mouse monoclonal IgG Sigma-Aldrich F3165
BioMax MS film Carestream 8294985
Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate, 450 mL Bio-Rad 5000006
B23 mouse monoclonal IgG Santa Cruz Biotechnologies sc-47725
Bromophenol blue Sigma-Aldrich B0126
Carnation non-fat powdered milk Nestle N/A
Cell scraper ThermoFisher Scientific 179693PK
C18IonKey nanoTile column Waters 186003763
Corning 100-mm TC-treated culture dishes Fisher Scientific 08-772-22
Dithiothreitol Thermo Scientific J1539714
1 x DPBS Corning 21-030-CVRS
ECL Estern blotting substrate Pierce 32106
Ethanol, 200 proof Fisher Chemical A409-4
FBS Gibco 16000044
Formic Acid Fisher Chemical A117-50
GelCode blue stain reagent ThermoFisher 24590
Glycerol Fisher Chemical 56-81-5
goat-anti-mouse IgG-HRP Santa Cruz Biotechnologies sc-2005
Iodoacetamide ACROS Organics 122270050
KimWipe delicate task wiper Kimberly Clark Professional 34120
L-glutamine Gibco 25030081
Methanol Fisher Chemical 67-56-1
NanoAcuity UPLC Waters N/A
Pierce Silver Stain Kit Thermo Scientific 24600df
15-mL Polypropylene conical tube Falcon 352097
Prestained Protein Ladder, 10 to 180 kDa Thermo Scientific 26616
Protease inhibitor cocktail Roche 4693132001
Purified BSA New England Biolabs B9001
PVDF  Western blotting membrane Roche 3010040001
Sodium Pyruvate Gibco 11360070
10 x TBS Fisher Bioreagents BP2471500
TEMED BioRad 1610880edu
Triton X-100 detergent solution BioRad 1610407
Trizaic source Waters N/A
trypsin-EDTA Corning 25-051-CIS
Tween 20 BioRad 1706531
Synapt G2 mass spectrometer Waters N/A
Whatman filter paper Tisch Scientific 10427813

References

  1. Arizala, J. A. C., et al. Nucleolar Localization of HIV-1 Rev Is Required, Yet Insufficient for Production of Infectious Viral Particles. AIDS Research and Human Retroviruses. , (2018).
  2. Li, Y. P. Protein B23 is an important human factor for the nucleolar localization of the human immunodeficiency virus protein Tat. Journal of Virology. 71, 4098-4102 (1997).
  3. Szebeni, A., et al. Nucleolar protein B23 stimulates nuclear import of the HIV-1 Rev protein and NLS-conjugated albumin. Biochemistry. 36, 3941-3949 (1997).
  4. Truant, R., Cullen, B. R. The arginine-rich domains present in human immunodeficiency virus type 1 Tat and Rev function as direct importin beta-dependent nuclear localization signals. Molecular and Cellular Biology. 19, 1210-1217 (1999).
  5. Eirin-Lopez, J. M., Frehlick, L. J., Ausio, J. Long-term evolution and functional diversification in the members of the nucleophosmin/nucleoplasmin family of nuclear chaperones. Genetics. 173, 1835-1850 (2006).
  6. Frehlick, L. J., Eirin-Lopez, J. M., Ausio, J. New insights into the nucleophosmin/nucleoplasmin family of nuclear chaperones. BioEssays. 29, 49-59 (2007).
  7. Okuwaki, M., Matsumoto, K., Tsujimoto, M., Nagata, K. Function of nucleophosmin/B23, a nucleolar acidic protein, as a histone chaperone. FEBS Letters. 506, 272-276 (2001).
  8. Szebeni, A., Olson, M. O. Nucleolar protein B23 has molecular chaperone activities. Protein Science. 8, 905-912 (1999).
  9. Hingorani, K., Szebeni, A., Olson, M. O. Mapping the functional domains of nucleolar protein B23. Journal of Biological Chemistry. 275, 24451-24457 (2000).
  10. Borer, R. A., Lehner, C. F., Eppenberger, H. M., Nigg, E. A. Major nucleolar proteins shuttle between nucleus and cytoplasm. Cell. 56, 379-390 (1989).
  11. Yun, J. P., et al. Nucleophosmin/B23 is a proliferate shuttle protein associated with nuclear matrix. Journal of Cellular Biochemistry. 90, 1140-1148 (2003).
  12. Savkur, R. S., Olson, M. O. Preferential cleavage in pre-ribosomal RNA byprotein B23 endoribonuclease. Nucleic Acids Research. 26, 4508-4515 (1998).
  13. Herrera, J. E., Savkur, R., Olson, M. O. The ribonuclease activity of nucleolar protein B23. Nucleic Acids Research. 23, 3974-3979 (1995).
  14. Grisendi, S., et al. Role of nucleophosmin in embryonic development and tumorigenesis. Nature. 437, 147-153 (2005).
  15. Itahana, K., et al. Tumor suppressor ARF degrades B23, a nucleolar protein involved in ribosome biogenesis and cell proliferation. Molecular Cell. 12, 1151-1164 (2003).
  16. Ye, K. Nucleophosmin/B23, a multifunctional protein that can regulate apoptosis. Cancer Biology & Therapy. 4, 918-923 (2005).
  17. Kuo, M. L., den Besten, W., Bertwistle, D., Roussel, M. F., Sherr, C. J. N-terminal polyubiquitination and degradation of the Arf tumor suppressor. Genes & Development. 18, 1862-1874 (2004).
  18. Kuo, M. L., den Besten, W., Thomas, M. C., Sherr, C. J. Arf-induced turnover of the nucleolar nucleophosmin-associated SUMO-2/3 protease Senp3. Cell Cycle. 7, 3378-3387 (2008).
  19. Horn, H. F., Vousden, K. H. Cancer: guarding the guardian. Nature. 427, 110-111 (2004).
  20. Grisendi, S., Mecucci, C., Falini, B., Pandolfi, P. P. Nucleophosmin and cancer. Nature Reviews Cancer. 6, 493-505 (2006).
  21. Dingwall, C., et al. Nucleoplasmin cDNA sequence reveals polyglutamic acid tracts and a cluster of sequences homologous to putative nuclear localization signals. The EMBO Journal. 6, 69-74 (1987).
  22. Fankhauser, C., Izaurralde, E., Adachi, Y., Wingfield, P., Laemmli, U. K. Specific complex of human immunodeficiency virus type 1 rev and nucleolar B23 proteins: dissociation by the Rev response element. Molecular and Cellular Biology. 11, 2567-2575 (1991).
  23. Valdez, B. C., et al. Identification of the nuclear and nucleolar localization signals of the protein p120. Interaction with translocation protein B23. Journal of Biological Chemistry. 269, 23776-23783 (1994).
  24. Li, Y. P., Busch, R. K., Valdez, B. C., Busch, H. C23 interacts with B23, a putative nucleolar-localization-signal-binding protein. European Journal of Biochemistry/FEBS. 237, 153-158 (1996).
  25. Adachi, Y., Copeland, T. D., Hatanaka, M., Oroszlan, S. Nucleolar targeting signal of Rex protein of human T-cell leukemia virus type I specifically binds to nucleolar shuttle protein B-23. Journal of Biological Chemistry. 268, 13930-13934 (1993).
  26. Szebeni, A., Herrera, J. E., Olson, M. O. Interaction of nucleolar protein B23 with peptides related to nuclear localization signals. Biochemistry. 34, 8037-8042 (1995).
  27. Tsuda, Y., et al. Nucleolar protein B23 interacts with Japanese encephalitis virus core protein and participates in viral replication. Microbiology and Immunology. 50, 225-234 (2006).
  28. Ning, B., Shih, C. Nucleolar localization of human hepatitis B virus capsid protein. Journal of Virology. 78, 13653-13668 (2004).
  29. Lee, S. J., Shim, H. Y., Hsieh, A., Min, J. Y., Jung, G. Hepatitis B virus core interacts with the host cell nucleolar protein, nucleophosmin 1. Journal of Microbiology. 47, 746-752 (2009).
  30. Huang, W. H., Yung, B. Y., Syu, W. J., Lee, Y. H. The nucleolar phosphoprotein B23 interacts with hepatitis delta antigens and modulates the hepatitis delta virus RNA replication. Journal of Biological Chemistry. 276, 25166-25175 (2001).
  31. Li, Y. J., Macnaughton, T., Gao, L., Lai, M. M. RNA-templated replication of hepatitis delta virus: genomic and antigenomic RNAs associate with different nuclear bodies. Journal of Virology. 80, 6478-6486 (2006).
  32. Yang, T. H., et al. Purification and characterization of nucleolin and its identification as a transcription repressor. Molecular and Cellular Biology. 14, 6068-6074 (1994).
  33. Sarek, G., et al. Nucleophosmin phosphorylation by v-cyclin-CDK6 controls KSHV latency. PLoS Pathogens. 6, 1000818 (2010).

Play Video

Cite This Article
Arizala, J. A. C., Chomchan, P., Li, H., Moore, R., Ge, H., Ouellet, D. L., Rossi, J. J. Identification of Nucleolar Factors During HIV-1 Replication Through Rev Immunoprecipitation and Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (148), e59329, doi:10.3791/59329 (2019).

View Video