Visualisering af lymfeknude struktur og cellulær lokalisering ved hjælp af ex vivo-Konfokal mikroskopi

Summary

Denne protokol beskriver en teknik til at afbilde forskellige cellepopulationer i dræne lymfeknuder uden ændringer i organ strukturen.

Abstract

Lymfeknuder (LNs) er organer spredt i kroppen, hvor den medfødte immunrespons kan forbinde med den adaptive immunitet. Faktisk er LNS strategisk indskudt i vejen for lymfe skibene, så intim kontakt af vævs antigener med alle residente immunceller i LN. Således, forstå den cellulære sammensætning, fordeling, placering og interaktion ved hjælp af ex vivo hele LN Imaging vil tilføje til viden om, hvordan kroppen koordinerer lokale og systemiske immunrespons. Denne protokol viser en ex vivo-billedbehandlings strategi efter en in vivo-administration af fluorescerende-mærkede antistoffer, der muliggør en meget reproducerbar og let-at-udføre metodologi ved hjælp af konventionelle konfokale mikroskoper og lager reagenser. Ved subkutan injektion af antistoffer er det muligt at mærke forskellige cellepopulationer i dræne LNs uden at påvirke vævsstrukturer, der potentielt kan blive beskadiget af en konventionel immunofluorescens mikroskopi teknik.

Introduction

Lymfeknuder (LNs) er ovoid-formede organer bredt til stede i hele kroppen med den afgørende funktion af bridging den medfødte og adaptive immunrespons. LNs filtrerer lymfeknuder for at identificere fremmede partikler og kræftceller til at montere en immunrespons mod dem¹. Antigen præsenterer celler (APCs), T-celler og B-celler arbejde sammen for at generere antigen-specifikke antistoffer (humoral immunitet) og cytotoksiske lymfocytter (cellulære immunitet) for at eliminere fremmede partikler og kræftceller². Således, forstå dynamikken i immuncellerne til stede i lymfesystemet vil have vigtige konsekvenser for vaccine udvikling og kræft immunterapi.

Fremkomsten af kraftfulde mikroskoper-herunder nye konfokale og super resolution mikroskoper-har tilladt en ekstraordinær avancement i forståelsen af, hvordan forskellige immuncelle populationer opfører sig i deres oprindelige miljø³. Det er nu muligt at afbilde flere samtidige celle-undertyper ved hjælp af en kombination af sonder med genetisk modificerede mus, som udtrykker fluorescerende proteiner under kontrol af specifikke mål^4,5. Faktisk, høje dimensionelle teknikker, herunder massecytometri og multi-parametrisk flow analyse har været afgørende for at udvide vores viden om forskellige immuncelle opdeling og funktionalitet i sundhed og sygdom^{6, 7}. men for at forberede prøverne til disse teknikker, væv har brug for fordøjelsen og celler adskilles fra deres naturlige miljø, der skal analyseres i celle suspensioner. For at overgå disse begrænsninger og tillade en bedre oversættelse i biologi, er målet med den foreslåede protokol at anvende en enkel metode til at afbilde ex vivo hele lymfeknuder ved hjælp af lager konfokale mikroskoper med fordel for forbedret hastighed, vævs og cellernes levedygtighed i forhold til den konventionelle immunofluorescens farvning. Ved at bruge denne fremgangsmåde, vi var i stand til at vise, at mus mangelfuld for γδ T celler, en under type af T lymfocyt involveret i vært tidligt forsvar mod patogener⁴, har kompromitteret follikler og T celle zoner i forhold til vildtype mus. Disse fund gjorde det muligt for os at forfølge en undersøgelse, hvor vi påviste, at γδ T-celler spiller en afgørende rolle i homøostase af lymfoide organer og humorale immunrespons⁴. Endvidere, denne protokol giver en fysiologisk vej for sonder og antistoffer til at nå lymfeknude, da de administreres subkutant og sprede gennem vævs lymfe kredsløb, bygger på tidligere rapporter, der anvendes in situ mærkning med antistoffer til at visualisere lymfe-associerede strukturer^8,9, avlsmateriale Center Dynamics^10,11,12, og mål let tilgængelige for blodgennemstrømningen^{13 ,14,15}.

Protocol

Protokollen blev godkendt af den stående Komité for dyr på Harvard Medical School og Brigham and Women’s Hospital, protokol 2016N000230. 1. mus, der anvendes til eksperimentet Brug 8-ugers gamle mandlige og hunmus på B6-baggrund til administration af antistof blandingen. Brug CX3CR1Gfp/WTCCR2RFP/WT -mus til at afgøre, om ex vivo-hele LN-billeddannelse også kan anvendes på reporter-mus uden at administrere antistofmix samt undersøge tilstedevær…

Representative Results

Dette manuskript viser teknikker til at fjerne lyske og popliteale lymfeknuder uden at beskadige deres struktur efter injektion af fluorescerende-mærkede antistoffer til at plette specifikke cellepopulationer i disse organer (figur 1 og figur 2 ). Den kraftfulde kombination af immunolabeling af LN celler med BV421 anti-CD4 og BB515 anti-CD19 og konfokale Imaging analyse defineret lokalisering af T-celler (CD4 +) og B-celler (CD19 +) …

Discussion

Kombinationen af billeddannelse med andre teknikker, herunder molekylær biologi og højdimensionel immunophenotyping, har forbedret vores evne til at undersøge immunceller i deres oprindelige kontekst. Mens andre tilgange kan kræve vævs fordøjelse og celle isolation – hvilket kan føre til tab af vævs integritet – giver brugen af in vivo-eller ex vivo-billeddannelse en stor fordel i at undersøge forskellige celle undertyper på en geografisk måde^{3 , 16</sup…}

Materials

BV421 anti-CD4	BD Horizon	562891	GK1.5; 0.2 mg mL-1
BB515 anti-CD19	BD Horizon	564509	1D3; 0.2 mg mL-1
BB515 Rat IgG2a, κ Isotype Control	BD Horizon	564418	R35-95; 0.2 mg mL-1
BV421 Mouse IgG2b, K Isotype Control	BD Horizon	562603	R35-38 0.2 mg mL-1
Cellview culture dish	Greiner-Bio	627861	35×10 mm with glass bottom
Insulin syringes	BD Plastipak	–	Insulin U-100
Kimwipes	Kimtech Science Brand	7557	size 21 x 20 cm / 100 sheets per box
Microsurgery curved forceps	WEP Surgical Instruments	custom made	12.5 cm
Microsurgery curved scissors	WEP Surgical Instruments	custom made	11.5 cm
Needle	BD PrecisionGlide	–	30 gauge × ½ inch
Nikon Eclipse Te + A1R confocal head	Nikon	–	loaded with main 4 laser lines (405, 488, 543 and 647 nm)
PE anti-F4/80	BD Pharmigen	565410	T45-2342; 0.2 mg mL-1
PE Rat IgG2a, κ Isotype Control	BD Pharmigen	553930	R35-95; 0.2 mg mL-1
Zeiss LSM 710 confocal microscope	Zeiss	–	loaded with main 4 laser lines (405, 488, 543 and 647 nm)