生体共焦点顕微鏡を用いてリンパ節構造と細胞局在化を可視化
Summary
このプロトコルは、臓器構造に変化を起さずにリンパ節を排出する異なる細胞集団を画像化する技術を説明する。
Abstract
リンパ節(LN)は体内に広がる器官であり、自然免疫応答が適応免疫とつながる。実際、LNはリンパ管の経路に戦略的に介入され、LN内のすべての常駐免疫細胞と組織抗原との親密な接触を可能にする。したがって、ex vivo全体LNイメージングを用いて細胞組成、分布、位置および相互作用を理解することは、身体が局所的および全身性免疫応答をどのように調整するかに関する知識を追加する。このプロトコルは、従来の共焦点顕微鏡およびストック試薬を用いて非常に再現性が高く、実行しやすい方法論を可能にする蛍光標識抗体の生体内投与に続くex vivoイメージング戦略を示す。抗体の皮下注射を通じて、従来の免疫蛍光顕微鏡技術によって損傷を受ける可能性のある組織構造に影響を与えることなく、RNを排出する異なる細胞集団に標識することができる。
Introduction
リンパ節(LN)は、自然免疫応答と適応免疫応答を橋渡しする重要な機能を持つ全身に広く存在する卵形の器官である。LNは、それらに対する免疫応答をマウントするために異物粒子および癌細胞を同定するためにリンパを濾過する1.抗原提示細胞(APC)、T細胞およびB細胞は、抗原特異的抗体(体液性免疫)および細胞傷害性リンパ球(細胞性免疫)を生成するために一緒に働き、外来粒子および癌細胞2を排除する。したがって、リンパ系に存在する免疫細胞のダイナミクスを理解することは、ワクチン開発とがん免疫療法に重要な意味を持つであろう。
新しい共焦点顕微鏡と超解像顕微鏡を含む強力な顕微鏡の出現は、異なる免疫細胞集団が彼らのネイティブ環境でどのように振る舞うかを理解する上で並外れた進歩を可能にしました3。特定の標的4、5の制御下で蛍光タンパク質を発現する遺伝子組み換えマウスとのプローブの組み合わせを用いて、複数の同時細胞サブタイプを画像化することが可能となった。実際、質量サイトメトリーやマルチパラメトリックフロー解析などの高次元技術は、健康と疾患における異なる免疫細胞の区画化と機能性に関する知識を拡大するために重要であり、7.しかし、これらの技術のためのサンプルを調用するために、組織は消化を必要とし、細胞は細胞懸濁液で分析される自然なmilieuから分離される。これらの制限を超え、生物学のより良い翻訳を可能にするために、ここで提案されるプロトコルの目標は、改善された速度、組織の利点を持つストック共焦点顕微鏡を使用して、画像ex vivo全リンパ節に簡単な方法論を適用することです。構造保存、および従来の免疫蛍光染色と比較した細胞生存率。このアプローチを用いて、病原体4に対する宿主早期防御に関与するTリンパ球のサブタイプであるγδ T細胞に対するマウス欠損が、野生型マウスと比較して卵胞およびT細胞ゾーンを損なっていることを示すことができた。これらの知見により、βT細胞がリンパ球器官の恒常性と体液性免疫応答4の恒常性において重要な役割を果たすことを実証した研究を行うことが可能となった。さらに、このプロトコルは、プローブと抗体がリンパ節に到達するための生理学的経路を提供し、皮下に投与され、組織リンパ循環を通じて消散するので、その場標識で使用された以前の報告に基づいて構築するリンパ系関連構造8、9、胚中心ダイナミクス10、11、12、および血流に容易にアクセス可能な標的を可視化する抗体を用いて13 、14、15.
Protocol
Representative Results
Discussion
イメージングと分子生物学や高次元免疫表現型を含む他の技術との組み合わせは、免疫細胞をネイティブの文脈で調べる能力を高めています。実際、他のアプローチでは組織の消化と細胞の単離が必要になる場合がありますが、組織の完全性を失う可能性がありますが、生体内またはex vivoイメージングを使用すると、地理的な方法で異なる細胞サブタイプを調査する上で大…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品はNIH(R01 AI43458~H.L.W.)によってサポートされました。
Materials
| BV421 anti-CD4 | BD Horizon | 562891 | GK1.5; 0.2 mg mL-1 |
| BB515 anti-CD19 | BD Horizon | 564509 | 1D3; 0.2 mg mL-1 |
| BB515 Rat IgG2a, κ Isotype Control | BD Horizon | 564418 | R35-95; 0.2 mg mL-1 |
| BV421 Mouse IgG2b, K Isotype Control | BD Horizon | 562603 | R35-38 0.2 mg mL-1 |
| Cellview culture dish | Greiner-Bio | 627861 | 35×10 mm with glass bottom |
| Insulin syringes | BD Plastipak | – | Insulin U-100 |
| Kimwipes | Kimtech Science Brand | 7557 | size 21 x 20 cm / 100 sheets per box |
| Microsurgery curved forceps | WEP Surgical Instruments | custom made | 12.5 cm |
| Microsurgery curved scissors | WEP Surgical Instruments | custom made | 11.5 cm |
| Needle | BD PrecisionGlide | – | 30 gauge × ½ inch |
| Nikon Eclipse Te + A1R confocal head | Nikon | – | loaded with main 4 laser lines (405, 488, 543 and 647 nm) |
| PE anti-F4/80 | BD Pharmigen | 565410 | T45-2342; 0.2 mg mL-1 |
| PE Rat IgG2a, κ Isotype Control | BD Pharmigen | 553930 | R35-95; 0.2 mg mL-1 |
| Zeiss LSM 710 confocal microscope | Zeiss | – | loaded with main 4 laser lines (405, 488, 543 and 647 nm) |
References
- Willard-Mack, C. L. Normal structure, function, and histology of lymph nodes. Toxicologic Pathology. 34, 409-424 (2006).
- Tas, J. M., et al. Visualizing antibody affinity maturation in germinal centers. Science. 351, 1048-1054 (2016).
- David, B. A., et al. Combination of Mass Cytometry and Imaging Analysis Reveals Origin, Location, and Functional Repopulation of Liver Myeloid Cells in Mice. Gastroenterology. 151, 1176-1191 (2016).
- Rezende, R. M., et al. gammadelta T cells control humoral immune response by inducing T follicular helper cell differentiation. Nature Communications. 9, 3151 (2018).
- Nakagaki, B. N., et al. Generation of a triple-fluorescent mouse strain allows a dynamic and spatial visualization of different liver phagocytes in vivo. Anais da Academia Brasileira de Ciencias. 91 (suppl 1), e20170317 (2019).
- Ajami, B., et al. Single-cell mass cytometry reveals distinct populations of brain myeloid cells in mouse neuroinflammation and neurodegeneration models. Nature Neuroscience. 21, 541-551 (2018).
- Becher, B., et al. High-dimensional analysis of the murine myeloid cell system. Nature Immunology. 15, 1181-1189 (2014).
- McElroy, M., et al. Fluorescent LYVE-1 antibody to image dynamically lymphatic trafficking of cancer cells in vivo. Journal of Surgical Research. 151, 68-73 (2009).
- Gerner, M. Y., Casey, K. A., Kastenmuller, W., Germain, R. N. Dendritic cell and antigen dispersal landscapes regulate T cell immunity. The Journal of Experimental Medicine. 214, 3105-3122 (2017).
- Hauser, A. E., et al. Definition of germinal-center B cell migration in vivo reveals predominant intrazonal circulation patterns. Immunity. 26, 655-667 (2007).
- Allen, C. D., Okada, T., Tang, H. L., Cyster, J. G. Imaging of germinal center selection events during affinity maturation. Science. 315, 528-531 (2007).
- Arnon, T. I., Horton, R. M., Grigorova, I. L., Cyster, J. G. Visualization of splenic marginal zone B-cell shuttling and follicular B-cell egress. Nature. 493, 684-688 (2013).
- Sipkins, D. A., et al. In vivo imaging of specialized bone marrow endothelial microdomains for tumour engraftment. Nature. 435, 969-973 (2005).
- Cinamon, G., Zachariah, M. A., Lam, O. M., Foss, F. W., Cyster, J. G. Follicular shuttling of marginal zone B cells facilitates antigen transport. Nature Immunology. 9, 54-62 (2008).
- Pereira, J. P., An, J., Xu, Y., Huang, Y., Cyster, J. G. Cannabinoid receptor 2 mediates the retention of immature B cells in bone marrow sinusoids. Nature Immunology. 10, 403-411 (2009).
- Nakagaki, B. N., et al. Immune and metabolic shifts during neonatal development reprogram liver identity and function. Journal of Hepatology. (6), 1294-1307 (2018).
- Wang, H., La Russa, M., Qi, L. S. CRISPR/Cas9 in Genome Editing and Beyond. Annual Review of Biochemistry. 85, 227-264 (2016).
- Roozendaal, R., et al. Conduits mediate transport of low-molecular-weight antigen to lymph node follicles. Immunity. 30, 264-276 (2009).
- Sarder, P., et al. All-near-infrared multiphoton microscopy interrogates intact tissues at deeper imaging depths than conventional single- and two-photon near-infrared excitation microscopes. Journal of Biomedical Optics. 18, 106012 (2013).
