Visualisering av lymfe node struktur og Cellular lokalisering bruker ex-vivo Konfokalmikroskopi mikroskopi
Summary
Denne protokollen beskriver en teknikk for å bilde forskjellige celle populasjoner i drenering lymfeknuter uten endringer i organ strukturen.
Abstract
Lymfeknuter (LNs) er organer spredt i kroppen, der de medfødte immunresponser kan koble med adaptive immunitet. Faktisk LNs er strategisk interposed i banen av lymfesystemet fartøy, slik intim kontakt av vev antigener med alle bosatt immunceller i LN. Således, forståelse det cellular komposisjonen, distribusjon, plasseringen og vekselvirkningen benytter ex vivo hele LN tenkelig ville legge til kunnskapen opp på hvor kroppen koordinater innenbys og systemisk immun svar. Denne protokollen viser en ex vivo avbildnings strategi etter en in vivo-administrasjon av fluorescerende-merkede antistoffer som tillater en svært reproduserbar og enkel å utføre metodikk ved hjelp av konvensjonelle konfokalmikroskopi mikroskop og lager reagenser. Gjennom subkutan injeksjon av antistoffer, er det mulig å merke forskjellige celle populasjoner i drenering LNs uten å påvirke vev strukturer som kan potensielt skades av en konvensjonell immunofluorescence mikroskopi teknikk.
Introduction
Lymfeknuter (LNs) er ovale-formede organer allment tilstede i hele kroppen med den avgjørende funksjon av å bygge bro over medfødte og adaptive immunresponser. LNs filtrere lymfe for å identifisere fremmede partikler og kreftceller for å montere en immunrespons mot dem1. Antigen presentere celler (APCs), T-celler og B-celler arbeide sammen for å generere antigen-spesifikke antistoffer (humoral immunitet) og cytotoksisk lymfocytter (cellulær immunitet) for å eliminere de fremmede partikler og kreftceller2. Dermed forstå dynamikken i immunceller til stede i lymfesystemet vil ha viktige implikasjoner for vaksinen utvikling og kreft immunterapi.
Ankomsten av kraftige mikroskop-inkludert nye konfokalmikroskopi og super oppløsning mikroskop-har tillatt en ekstraordinær fremgang i å forstå hvordan ulike immun celle populasjoner oppfører seg i sitt eget miljø3. Det er nå mulig å avbilde flere samtidige celle under typer ved hjelp av en kombinasjon av sonder med genmodifiserte mus som uttrykker fluorescerende proteiner under kontroll av konkrete mål4,5. Faktisk, høy dimensjonal teknikker, inkludert masse flowcytometri og multi-parametrisk flyt analyse har vært avgjørende for å utvide vår kunnskap om ulike immun celle compartmentalization og funksjonalitet i helse og sykdom6, 7. men for å forberede prøvene for disse teknikkene, trenger vev fordøyelse og celler er adskilt fra sitt naturlige miljø for å bli analysert i celle suspensjoner. Å overgå disse begrensningene og tillate en bedre oversettelse i biologi, målet for protokollen foreslås her er å bruke en grei metodikk til bilde ex vivo hele lymfeknuter ved hjelp av lager konfokalmikroskopi mikroskop med fordel for forbedret hastighet, vev strukturbevaring, og celle levedyktighet i forhold til den konvensjonelle immunofluorescence farging. Ved å bruke denne tilnærmingen, var vi i stand til å vise at mus mangelfull for γδ T-celler, en under type av T-lymfocytter involvert i vert tidlig forsvar mot patogener4, har kompromittert sekker og T celle soner sammenlignet med vill type mus. Disse funnene tillot oss å forfølge en studie der vi viste at γδ T-celler spiller en avgjørende rolle i homeostase av lymfoide organer og humoral immunrespons4. Videre gir denne protokollen en fysiologiske vei for sonder og antistoffer for å nå lymfeknuter, som de administreres subkutant og spre gjennom vev lymfatisk sirkulasjon, bygge på tidligere rapporter som brukes in situ merking med antistoffer for å visualisere lymfatisk tilknyttede strukturer8,9, Germinal Center Dynamics10,11,12, og mål lett tilgjengelig for blodstrøm13 ,14,15.
Protocol
Representative Results
Discussion
Kombinasjonen av Imaging med andre teknikker, inkludert molekylærbiologi og høy dimensjonal immunfenotyping har styrket vår evne til å undersøke immunceller i sin opprinnelige sammenheng. Faktisk, mens andre tilnærminger kan kreve vev fordøyelse og celle isolasjon-som kan føre til tap av vev integritet-bruk av in vivo eller ex vivo Imaging gir en stor fordel i å undersøke ulike celle under typer i en geografisk mote3 , 16. det er ikke overraskende at ti…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av NIH (R01 AI43458 til H.L.W.).
Materials
| BV421 anti-CD4 | BD Horizon | 562891 | GK1.5; 0.2 mg mL-1 |
| BB515 anti-CD19 | BD Horizon | 564509 | 1D3; 0.2 mg mL-1 |
| BB515 Rat IgG2a, κ Isotype Control | BD Horizon | 564418 | R35-95; 0.2 mg mL-1 |
| BV421 Mouse IgG2b, K Isotype Control | BD Horizon | 562603 | R35-38 0.2 mg mL-1 |
| Cellview culture dish | Greiner-Bio | 627861 | 35×10 mm with glass bottom |
| Insulin syringes | BD Plastipak | – | Insulin U-100 |
| Kimwipes | Kimtech Science Brand | 7557 | size 21 x 20 cm / 100 sheets per box |
| Microsurgery curved forceps | WEP Surgical Instruments | custom made | 12.5 cm |
| Microsurgery curved scissors | WEP Surgical Instruments | custom made | 11.5 cm |
| Needle | BD PrecisionGlide | – | 30 gauge × ½ inch |
| Nikon Eclipse Te + A1R confocal head | Nikon | – | loaded with main 4 laser lines (405, 488, 543 and 647 nm) |
| PE anti-F4/80 | BD Pharmigen | 565410 | T45-2342; 0.2 mg mL-1 |
| PE Rat IgG2a, κ Isotype Control | BD Pharmigen | 553930 | R35-95; 0.2 mg mL-1 |
| Zeiss LSM 710 confocal microscope | Zeiss | – | loaded with main 4 laser lines (405, 488, 543 and 647 nm) |
References
- Willard-Mack, C. L. Normal structure, function, and histology of lymph nodes. Toxicologic Pathology. 34, 409-424 (2006).
- Tas, J. M., et al. Visualizing antibody affinity maturation in germinal centers. Science. 351, 1048-1054 (2016).
- David, B. A., et al. Combination of Mass Cytometry and Imaging Analysis Reveals Origin, Location, and Functional Repopulation of Liver Myeloid Cells in Mice. Gastroenterology. 151, 1176-1191 (2016).
- Rezende, R. M., et al. gammadelta T cells control humoral immune response by inducing T follicular helper cell differentiation. Nature Communications. 9, 3151 (2018).
- Nakagaki, B. N., et al. Generation of a triple-fluorescent mouse strain allows a dynamic and spatial visualization of different liver phagocytes in vivo. Anais da Academia Brasileira de Ciencias. 91 (suppl 1), e20170317 (2019).
- Ajami, B., et al. Single-cell mass cytometry reveals distinct populations of brain myeloid cells in mouse neuroinflammation and neurodegeneration models. Nature Neuroscience. 21, 541-551 (2018).
- Becher, B., et al. High-dimensional analysis of the murine myeloid cell system. Nature Immunology. 15, 1181-1189 (2014).
- McElroy, M., et al. Fluorescent LYVE-1 antibody to image dynamically lymphatic trafficking of cancer cells in vivo. Journal of Surgical Research. 151, 68-73 (2009).
- Gerner, M. Y., Casey, K. A., Kastenmuller, W., Germain, R. N. Dendritic cell and antigen dispersal landscapes regulate T cell immunity. The Journal of Experimental Medicine. 214, 3105-3122 (2017).
- Hauser, A. E., et al. Definition of germinal-center B cell migration in vivo reveals predominant intrazonal circulation patterns. Immunity. 26, 655-667 (2007).
- Allen, C. D., Okada, T., Tang, H. L., Cyster, J. G. Imaging of germinal center selection events during affinity maturation. Science. 315, 528-531 (2007).
- Arnon, T. I., Horton, R. M., Grigorova, I. L., Cyster, J. G. Visualization of splenic marginal zone B-cell shuttling and follicular B-cell egress. Nature. 493, 684-688 (2013).
- Sipkins, D. A., et al. In vivo imaging of specialized bone marrow endothelial microdomains for tumour engraftment. Nature. 435, 969-973 (2005).
- Cinamon, G., Zachariah, M. A., Lam, O. M., Foss, F. W., Cyster, J. G. Follicular shuttling of marginal zone B cells facilitates antigen transport. Nature Immunology. 9, 54-62 (2008).
- Pereira, J. P., An, J., Xu, Y., Huang, Y., Cyster, J. G. Cannabinoid receptor 2 mediates the retention of immature B cells in bone marrow sinusoids. Nature Immunology. 10, 403-411 (2009).
- Nakagaki, B. N., et al. Immune and metabolic shifts during neonatal development reprogram liver identity and function. Journal of Hepatology. (6), 1294-1307 (2018).
- Wang, H., La Russa, M., Qi, L. S. CRISPR/Cas9 in Genome Editing and Beyond. Annual Review of Biochemistry. 85, 227-264 (2016).
- Roozendaal, R., et al. Conduits mediate transport of low-molecular-weight antigen to lymph node follicles. Immunity. 30, 264-276 (2009).
- Sarder, P., et al. All-near-infrared multiphoton microscopy interrogates intact tissues at deeper imaging depths than conventional single- and two-photon near-infrared excitation microscopes. Journal of Biomedical Optics. 18, 106012 (2013).
