استخدام الكنورهابدية إليجانس لدراسة الآثار عبر الأجيال ومتعددة من المواد السامة
Summary
والآثار العابرة للأجيال للمواد الكيميائية الثابتة ضرورية للحكم على آثارها الطويلة الأجل في البيئة وعلى صحة الإنسان. نحن نقدم طرق مفصلة جديدة لدراسة الآثار عبر ومتعددة الأجيال باستخدام الديدان الخيطية الحية الحرة Caenorhabditis elegans.
Abstract
والمعلومات المتعلقة بسمية المواد الكيميائية ضرورية في تطبيقها وإدارة النفايات. وبالنسبة للمواد الكيميائية ذات التركيزات المنخفضة، فإن الآثار الطويلة الأجل هامة جداً في الحكم على آثارها في البيئة وعلى صحة الإنسان. وفي إظهار التأثيرات الطويلة الأجل، توفر آثار المواد الكيميائية على مدى أجيال في الدراسات الحديثة رؤية جديدة. هنا، ونحن نوصف بروتوكولات لدراسة آثار المواد الكيميائية على أجيال متعددة باستخدام الديدان الخيطية الحية الحرة Caenorhabditis elegans. ويُعرض جانبان هما: (1) دراسات الأثر عبر الأجيال (TG) و (2) التي تُفصل هذه الأخيرة إلى دراسات عن التعرض المتعدد الأجيال ودراسات الأثر المتبقية المتعددة الأجيال. دراسة تأثير TG قوية لغرض بسيط لتحديد ما إذا كان التعرض الكيميائي للوالدين يمكن أن يؤدي إلى أي عواقب متبقية على الذرية. بعد قياس الآثار على الآباء والأمهات، وتستخدم حلول هيبوكلوريت الصوديوم لقتل الوالدين والحفاظ على الذرية وذلك لتسهيل قياس تأثير على الذرية. يتم استخدام دراسة تأثير TG لتحديد ما إذا كان يتأثر الذرية عندما يتعرض أحد الوالدين للملوثات. وتُستخدم دراسة تأثير MGE وMGR بشكل منهجي لتحديد ما إذا كان التعرض المستمر للأجيال يمكن أن يؤدي إلى استجابات متكيفة في الذرية على مر الأجيال. وتستخدم بعناية البيك اب ونقل للتمييز بين الأجيال لتسهيل قياس تأثير على كل جيل. كما قمنا بدمج بروتوكولات لقياس سلوك الحركة، والتكاثر، وعمرها، والتغيرات في التعبير الكيميائي الحيوي والتعبير الجيني. كما تُقدَّم بعض التجارب على سبيل المثال لتوضيح دراسات الأثر عبر الأجيال ومتعددةها.
Introduction
ويعتمد تطبيق المواد الكيميائية وإدارتها اعتماداً كبيراً على المعلومات المتعلقة بآثارها بتركيزات معينة. وتجدر الإشارة إلى أن الوقت عنصر أساسي آخر بين الآثار والتركيزات. وهذا يعني أن المواد الكيميائية، ولا سيما تلك ذات التركيزات المنخفضة في البيئات الفعلية، تحتاج إلى وقت لإثارة آثار قابلة للقياس1. ولذلك، يقوم الباحثون بترتيب أطوال مختلفة لمدة التعرض في التجارب الحيوانية، وحتى تغطية دورة الحياة بأكملها. على سبيل المثال، تعرضت الفئران للنيكوتين لمدة 30 أو 90 أو 180 يوما لدراسة آثاره السامة 2. ومع ذلك، فإن فترات التعرض هذه لا تزال غير كافية لتوضيح الآثار الطويلة الأجل للملوثات (مثل الملوثات العضوية الثابتة) التي يمكن أن تستمر على مدى أجيال من الكائنات الحية في البيئة. ولذلك، فإن الدراسات المتعلقة بالآثار على مر الأجيال تكتسب المزيد والمزيد من الاهتمام.
هناك جانبان رئيسيان في دراسات تأثير الأجيال. الأول هو دراسة تأثير عبر الأجيال (TG) التي يمكن أن تختبر بقوة ما إذا كان التعرض الكيميائي للوالدين يمكن أن يؤدي إلى أي عواقب على الذرية3. والثاني هو دراسة تأثير متعددة الأجيال التي هي أكثر منهجية مع اعتبارات في كل من التعرض والآثار المتبقية. فمن ناحية، تُستخدم آثار التعرض المتعدد الأجيال لتوضيح الاستجابات التكيفية في الحيوانات للبيئات الصعبة الطويلة الأجل. ومن ناحية أخرى، تُستخدم الآثار المتبقية المتعددة الأجيال لإثبات العواقب المتبقية الطويلة الأجل بعد التعرض، حيث أن تعرض الأمهات يصاحب التعرض للجنين للذرية الأولى والتعرض للخط الجرثومي للثاني الذرية مما يجعل الذرية الثالثة كالجيل الأول تماما من التعرض4.
وعلى الرغم من أن الثدييات (مثل الفئران) هي كائنات نموذجية في دراسات السمية خاصة فيما يتعلق بالبشر، فإن تطبيقها في دراسة آثار الأجيال يستغرق وقتاً طويلاً جداً ومكلفاً وأخلاقياً فيما يتعلق بـ 5. وفقا لذلك، الكائنات الحية بما في ذلك القشريات Daphnia ماجنا6، الحشرات دروسوفيلا melanogaster7 وحمار وحشي دانيو ريو8،وتوفير خيارات بديلة. ومع ذلك، فإن هذه الكائنات إما تفتقر إلى أوجه التشابه مع البشر، أو تتطلب معدات محددة في الدراسات.
Caenorhabditis elegans هو نيماتود صغير يعيش بحرية (حوالي 1 ملم في الطول) مع دورة حياة قصيرة (حوالي 84 ساعة في 20 درجة مئوية)9. هذا الديدان الخيطية تشترك في العديد من المسارات البيولوجية المحافظة على البشر، وبالتالي فقد استخدمت على نطاق واسع لتوضيح آثار الضغوط المختلفة أو المواد السامة10. وتجدر الإشارة إلى أن 99.5٪ من الديدان الخيطية هي hermaphrodites مما يجعل هذه الكائنات مناسبة للغاية في دراسة آثار الأجيال، على سبيل المثال، آثار TG من المعادن الثقيلة وsulfonamides3،11، آثار MGE من الجسيمات النانوية الذهب والثقيلة المعادن12 ودرجة الحرارة13، MGR آثار سلفوناميد14، وعلى حد سواء MGE وMGR آثار التشعيع غاما15 والليندين4. وعلاوة على ذلك، تم العثور على نتائج مماثلة بين آثار المواد الكيميائية (مثل zearalenone) على تطوير واستنساخ الفئران وC. elegans16،17، والتي من شأنها أن توفر ميزة لاستقراء الآثار من هذا الحيوان الصغير إلى البشر.
كل من TG وMG دراسات تأثير تستغرق وقتا طويلا وتحتاج إلى تصميم دقيق والأداء. وتجدر الإشارة إلى وجود اختلافات في خيارات مرحلة الحياة، وظروف التعرض، وأساليب فصل الأجيال في الدراسات المذكورة أعلاه. وتعوق هذه الاختلافات المقارنة المباشرة بين النتائج وتعوق المزيد من تفسير النتائج. ولذلك، لا بد من وضع بروتوكولات موحدة لتوجيه دراسات آثار الـ TG وMG، وكذلك تقديم صورة أكبر للكشف عن أنماط مماثلة من مختلف المواد السامة أو الملوثات في العواقب الطويلة الأجل. وسوف يظهر الهدف الزائد من هذه البروتوكولات عمليات عملية واضحة في دراسة الآثار عبر الأجيال ومتعددة مع C. elegans. وستستفيد البروتوكولات من الباحثين المهتمين بدراسة الآثار الطويلة الأجل للمواد السامة أو الملوثات.
Protocol
Representative Results
Discussion
ومن أجل تنفيذ البروتوكول الموصوف بنجاح، ينبغي أن تؤخذ في الاعتبار الاقتراحات التالية. تنفيذ العمليات التجريبية الشاملة في بيئة معقمة. قد تؤدي العملية غير السليمة إلى تلوث سلالات القولونية E. ، على سبيل المثال ، الفطريات والعث قد تعوق النمو الطبيعي لـ C. elegans وبالتالي تؤثر على النت…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Materials
| agar powder | OXOID, Thermo Fisher Scientific, UK | 9002-18-0 | |
| 79nnHT Fast Real-Time PCR System | Applied Biosystems | ||
| 96-well sterile microplate | Costar，Corning，America | ||
| Autoclave sterilizer | Tomy, Tomy Digital Biology, Japan | ||
| Biosafety cabinet | LongYue, Shanghai longyue instrument equipment co. Ltd, China | ||
| calcium chloride | Sinopharm chemical reagent company Ltd, China | 10043-52-4 | |
| centrifuge 5417R | Eppendorf, Ai Bende (Shanghai) International Trade Co., Ltd, Germany | ||
| Centrifuge tubes | Axygen, Aixjin biotechnology (Hangzhou) co. Ltd, America | ||
| cholesterol | Sinopharm chemical reagent company Ltd, China | 57-88-5 | |
| Dimethyl sulfoxide | VETEC, Sigmar aldrich (Shanghai) trading co. Ltd, America | 67-68-5 | |
| disodium hydrogen phosphate | Sinopharm chemical reagent company Ltd, China | 7558-79-4 | |
| ethanol | Sinopharm chemical reagent company Ltd, China | 64-17-5 | |
| Filter | Thermo, Thermo Fisher Scientific, America | ||
| incubator | YiHeng17, Shanghai yiheng scientific instrument co. Ltd, China | ||
| inoculating loop | |||
| K2HPO4•3H2O | Sinopharm chemical reagent company Ltd, China | 16788-57-1 | |
| kraft paper | |||
| Mcroplate Reader | Boitek, Boten apparatus co. Ltd, America | ||
| MgSO4•7H2O | Sinopharm chemical reagent company Ltd, China | 10034-99-8 | |
| Microscopes XTL-BM-9TD | BM, Shanghai BM optical instruments manufacturing co. Ltd, China | ||
| Petri dishes | |||
| Pipette | Eppendorf, Ai Bende (Shanghai) International Trade Co., Ltd, Germany | ||
| Potassium chloride | Sinopharm chemical reagent company Ltd, China | 7447-40-7 | |
| potassium dihydrogen phosphate | Sinopharm chemical reagent company Ltd, China | 7778-77-0 | |
| Qiagen RNeasy kits | Qiagen Inc., Valencia, CA, United States | ||
| QuantiTect SYBR Green RT-PCR kits | Qiagen Inc., Valencia, CA, United States | ||
| RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit | Thermo Scientific, Wilmington, DE, United States | ||
| sodium chloride | Sinopharm chemical reagent company Ltd, China | 7647-14-5 | |
| sodium hydroxide | Sinopharm chemical reagent company Ltd, China | 1310-73-2 | |
| sodium hypochlorite solution | Aladdin, Shanghai Aladdin biochemical technology co. Ltd, China | 7681-52-9 | |
| tryptone | OXOID, Thermo Fisher Scientific, UK | 73049-73-7 | |
| yeast extract | OXOID, Thermo Fisher Scientific, UK | 119-44-8 |
References
- Yu, Z., Zhang, J., Hou, M. The time-dependent stimulation of sodium halide salts on redox reactants, energy supply and luminescence in Vibrio fischeri. Journal of Hazardous Materials. 342, 429-435 (2018).
- Li, W., et al. Long-term nicotine exposure induces dysfunction of mouse endothelial progenitor cells. Experimental and Therapeutic. 13, 85-90 (2017).
- Yu, Z. Y., Chen, X. X., Zhang, J., Wang, R., Yin, D. Q. Transgenerational effects of heavy metals on L3 larva of Caenorhabditis elegans with greater behavior and growth inhibitions in the progeny. Ecotoxicology and Environmental Safety. 88C, 178-184 (2013).
- Chen, R., Yu, Z., Yin, D. Multi-generational effects of lindane on nematode lipid metabolism with disturbances on insulin-like signal pathway. Chemosphere. 210, 607-614 (2018).
- Van Norman, G. A. A matter of mice and men: ethical issues in animal experimentation. International Anesthesiology Clinics. 53 (3), 63-78 (2015).
- Pereira, C. M. S., Everaert, G., Blust, R., De Schamphelaere, K. A. C. Multigenerational effects of nickel on Daphnia magna depend on temperature and the magnitude of the effect in the first generation. Environmental Toxicology and Chemistry. 37 (7), 1877-1888 (2018).
- Morimoto, J., Simpson, S. J., Ponton, F. Direct and trans-generational effects of male and female gut microbiota in Drosophila melanogaster. Biology Letters. 13, 20160966 (2017).
- Coimbra, A. M., et al. Chronic effects of clofibric acid in zebrafish (Danio rerio): A multigenerational study. Aquatic Toxicology. 160, 76-86 (2015).
- Sugi, T. Genome editing in C. elegans and other nematode species. International Journal of Molecular Sciences. 17, 295 (2016).
- Leung, M. C. K., et al. Caenorhabditis elegans: an emerging model in biomedical and environmental toxicology. Toxicological Science. 106 (1), 5-28 (2008).
- Yu, Z. Y., Jiang, L., Yin, D. Q. Behavior toxicity to Caenorhabditis elegans transferred to the progeny after exposure to sulfamethoxazole at environmentally relevant concentration. Journal of Environmental Sciences-China. 23 (2), 294-300 (2011).
- Kim, S. W., Kwak, J. I., An, Y. J. Multigenerational study of gold nanoparticles in Caenorhabditis elegans: transgenerational effect of maternal exposure. Environmental Science & Technology. 47, 5393-5399 (2013).
- Klosin, A., Casas, E., Hidalgo-Carcedo, C., Vavouri, T., Lehner, B. Transgenerational transmission of environmental information in C. elegans. Science. 356, 320 (2017).
- Yu, Z. Y., et al. Trans-generational influences of sulfamethoxazole on lifespan, reproduction and population growth of Caenorhabditis elegans. Ecotoxicology and Environmental Safety. 135, 312-318 (2017).
- Buisset-Goussen, A., et al. Effects of chronic gamma irradiation: a multigenerational study using Caenorhabditis elegans. Radioactivity. 137, 190-197 (2014).
- Zhao, F., et al. Multigenerational exposure to dietary zearalenone (ZEA), anestrogenic mycotoxin, affects puberty and reproductionin female mice. Reproductive Toxicology. 47, 81-88 (2014).
- Yang, Z., Wang, J., Tang, L., Sun, X., Xue, K. S. Transgenerational comparison of developmental and reproductive toxicities in zearalenone exposed Caenorhabditis elegans. Asian Journal of Ecotoxicology. 11 (4), 61-68 (2016).
- Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis dlegans. Genetics. 77, 71-94 (1974).
- Emmons, S., Klass, M., Hirsch, D. An analysis of the constancy of DNA sequences during development and evolution of the nematode Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76, 1333-1337 (1979).
- Van Gilst, M. R., Hadjivassiliou, H., Yamamoto, K. R. A Caenorhabditis elegans nutrient response system partially dependent on nuclear receptor NHR-49. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (38), 13496-13501 (2005).
- Cobb, E., Hall, J., Palazzolo, D. L. Induction of metallothionein expression after exposure to conventional cigarette smoke but not electronic cigarette (ECIG)-generated aerosol in Caenorhabditis elegans. Frontiers in Physiology. 9, 426 (2018).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-ΔΔCT method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
- Hill, R., et al. Genetic flexibility in the convergent evolution of hermaphroditism in Caenorhabditis Nematodes. Developmental Cell. 10, 531-538 (2006).
- Cabreiro, F., Gems, D. Worms need microbes too: microbiota, health and aging in Caenorhabditis elegans. EMBO Molecular Medicine. 2013, 1300-1310 (2013).
- Breider, F., von Gunten, U. Quantification of total N-nitrosamine concentrations in aqueous samples via UV-photolysis and chemiluminescence detection of nitric oxide. Analytical Chemistry. 89 (3), 1574-1582 (2017).
