毒性物質のトランスおよび多世代効果の研究のためのカエナルハブ炎エレガンスの使用
Summary
永続的な化学物質のトランスおよび多世代の影響は、環境と人間の健康に対する長期的な影響を判断する上で不可欠です。我々は、自由に生きている線虫カエノルハブ炎エレガンスを用いて、トランスおよび多世代の効果を研究するための新しい詳細な方法を提供する。
Abstract
化学物質の毒性に関する情報は、その用途と廃棄物管理に不可欠です。低濃度の化学物質の場合、長期的な影響は、環境と人間の健康への影響を判断する上で非常に重要です。長期的な影響を実証する上で、最近の研究で世代を超えた化学物質の影響は、新しい洞察を提供します。ここでは、自由に生きている線虫カエオルハブ炎エレガンスを用いて、複数世代にわたる化学物質の効果を研究するためのプロトコルについて説明する。(1)トランスジェネレーション(TG)と(2)多世代効果研究、(後者)を多世代露光(MGE)と多世代残差(MGR)効果スタディに分ける2つの側面を提示する。TG効果研究は、親への化学暴露が子孫に残留結果をもたらす可能性があるかどうかを決定する単純な目的で堅牢です。効果が親に測定された後、次亜塩素酸ナトリウム溶液は、親を殺し、子孫に対する効果測定を容易にするために子孫を保つために使用されます。TG効果試験は、親が汚染物質にさらされたときに子孫が影響を受けるかどうかを判断するために使用されます。MGEおよびMGR効果試験は、連続的な世代暴露が世代を超えて子孫の適応応答をもたらす可能性があるかどうかを決定するために体系的に使用されます。慎重なピックアップと転送は、各世代の効果測定を容易にするために世代を区別するために使用されます。また、プロトコルを組み合わせて、移動挙動、生殖、寿命、生化学的および遺伝子発現の変化を測定しました。いくつかの実験例はまた、トランスおよび多世代効果研究を説明するために提示される。
Introduction
化学物質の適用および廃棄物管理は、特定の濃度での効果の情報に大きく依存します。特に、時間は効果と濃度の間のもう一つの重要な要素です。すなわち、化学物質、特に実際の環境で低濃度のものは、測定可能な効果を引き起こす時間を必要とします 1.したがって、研究者は、動物実験で露光期間の異なる長さを配置し、さらにはライフサイクル全体をカバーします。例えば、マウスは、その毒性効果2を研究するために30、90または180日間ニコチンにさらされた。 しかし、このような暴露期間は、環境中の生物の世代にわたって持続する汚染物質(例えば、持続的な有機汚染物質[POP])の長期的な影響を解明するのに十分ではありません。したがって、世代を超えた効果に関する研究はますます注目を集めています。
世代効果研究には主に2つの側面があります。1つ目は、親への化学暴露が子孫3に何らかの影響をもたらすかどうかを強くテストできるトランスジェネレーション(TG)効果試験です。2つ目は、露出効果と残留効果の両方を考慮した、より体系的な多世代効果研究です。一方で、多世代暴露(MGE)効果は、長期的に困難な環境に対する動物の適応応答を示すために使用される。一方、母体暴露は第1子子への胚暴露と第2の生殖線暴露を伴うため、多世代残差(MGR)効果は、暴露後の長期的な残留結果を実証するために使用される。第三世代として第三の子孫を露出から完全に外す子孫4.
哺乳動物(例えば、マウス)は、特にヒトに関連する毒性研究におけるモデル生物であるが、世代的影響の研究におけるその応用は非常に時間がかかり、高価で倫理的に5に関する。したがって、甲殻類ダフニアマグナ6、昆虫ショウジョウバエメラノガスター7およびゼブラフィッシュダニオレリオ8を含む生物は、代替選択肢を提供する。しかし、これらの生物は人間との類似性を欠いているか、研究に特定の装置を必要とします。
カエオルハブ炎エレガンスは、短いライフサイクル(20°Cで約84時間)9の小さな自由に生きている線虫(長さ約1mm)です。この線虫は、人間に対して保守的な多くの生物学的経路を共有し、したがって、様々なストレスまたは毒性物質10の効果を示すために広く採用されている。特に、線虫の99.5%は、重金属やスルホンアミド3、11、金ナノ粒子および重体のMGE効果の生成効果など、世代的効果の研究に非常に適したこの生物を作るハーマフロダイトである。金属12および温度13、スルホンアミド14のMGR効果、およびガンマ照射15およびリンダン4のMGEおよびMGR効果の両方が及ぶ。さらに、マウスとC.エレガンス16、17の発達および繁殖に及ぼす化学物質(例えばゼアラレノン)の効果との間に同等の結果が見出された。この小動物から人間への影響。
TG と MG 効果の研究は両方の時間がかかり、慎重な設計とパフォーマンスが必要です。.特に、前述の研究では、ライフステージの選択、暴露条件、および生成分離方法に違いが存在していました。このような違いは、結果間の直接比較を妨げ、結果のさらなる解釈を妨げました。したがって、TGおよびMG効果研究を導く統一プロトコルを確立し、また、長期的な結果における様々な毒性物質または汚染物質の同様のパターンを明らかにするために、より大きな画像を提供することが不可欠である。本プロトコルのオーバーゴールは、C.エレガンスとのトランスおよび多世代効果を研究する際の明確な操作プロセスを示す。プロトコルは、有毒物質や汚染物質の長期的な影響を研究することに興味を持っている研究者に利益をもたらす.
Protocol
Representative Results
Discussion
記述されたプロトコルを正常に実行するためには、次の提案を考慮する必要があります。無菌環境で全体的な実験操作を実行します。不適切な操作は、大腸菌株の汚染、例えば、真菌およびダニは、C.エレガンスの正常な成長を妨げる可能性があり、したがって、実験結果に影響を与える可能性があります。C.エレガンスの栽培について説明するセクションでは、裸眼また…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Materials
| agar powder | OXOID, Thermo Fisher Scientific, UK | 9002-18-0 | |
| 79nnHT Fast Real-Time PCR System | Applied Biosystems | ||
| 96-well sterile microplate | Costar，Corning，America | ||
| Autoclave sterilizer | Tomy, Tomy Digital Biology, Japan | ||
| Biosafety cabinet | LongYue, Shanghai longyue instrument equipment co. Ltd, China | ||
| calcium chloride | Sinopharm chemical reagent company Ltd, China | 10043-52-4 | |
| centrifuge 5417R | Eppendorf, Ai Bende (Shanghai) International Trade Co., Ltd, Germany | ||
| Centrifuge tubes | Axygen, Aixjin biotechnology (Hangzhou) co. Ltd, America | ||
| cholesterol | Sinopharm chemical reagent company Ltd, China | 57-88-5 | |
| Dimethyl sulfoxide | VETEC, Sigmar aldrich (Shanghai) trading co. Ltd, America | 67-68-5 | |
| disodium hydrogen phosphate | Sinopharm chemical reagent company Ltd, China | 7558-79-4 | |
| ethanol | Sinopharm chemical reagent company Ltd, China | 64-17-5 | |
| Filter | Thermo, Thermo Fisher Scientific, America | ||
| incubator | YiHeng17, Shanghai yiheng scientific instrument co. Ltd, China | ||
| inoculating loop | |||
| K2HPO4•3H2O | Sinopharm chemical reagent company Ltd, China | 16788-57-1 | |
| kraft paper | |||
| Mcroplate Reader | Boitek, Boten apparatus co. Ltd, America | ||
| MgSO4•7H2O | Sinopharm chemical reagent company Ltd, China | 10034-99-8 | |
| Microscopes XTL-BM-9TD | BM, Shanghai BM optical instruments manufacturing co. Ltd, China | ||
| Petri dishes | |||
| Pipette | Eppendorf, Ai Bende (Shanghai) International Trade Co., Ltd, Germany | ||
| Potassium chloride | Sinopharm chemical reagent company Ltd, China | 7447-40-7 | |
| potassium dihydrogen phosphate | Sinopharm chemical reagent company Ltd, China | 7778-77-0 | |
| Qiagen RNeasy kits | Qiagen Inc., Valencia, CA, United States | ||
| QuantiTect SYBR Green RT-PCR kits | Qiagen Inc., Valencia, CA, United States | ||
| RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit | Thermo Scientific, Wilmington, DE, United States | ||
| sodium chloride | Sinopharm chemical reagent company Ltd, China | 7647-14-5 | |
| sodium hydroxide | Sinopharm chemical reagent company Ltd, China | 1310-73-2 | |
| sodium hypochlorite solution | Aladdin, Shanghai Aladdin biochemical technology co. Ltd, China | 7681-52-9 | |
| tryptone | OXOID, Thermo Fisher Scientific, UK | 73049-73-7 | |
| yeast extract | OXOID, Thermo Fisher Scientific, UK | 119-44-8 |
References
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