Met behulp van Caenorhabditis elegans voor het bestuderen van trans-en multi-generationele effecten van toxicantia
Summary
Trans-en multi generationele effecten van persistente chemicaliën zijn essentieel voor het beoordelen van hun langetermijngevolgen in het milieu en op de menselijke gezondheid. Wij bieden nieuwe gedetailleerde methoden voor het bestuderen van trans-en multi-generationele effecten met behulp van Free-Living nematode Caenorhabditis elegans.
Abstract
Informatie over toxiciteiten van chemicaliën is essentieel in hun toepassing en afvalbeheer. Voor chemische stoffen in lage concentraties zijn de effecten op de lange termijn van groot belang voor de beoordeling van de gevolgen ervan voor het milieu en voor de gezondheid van de mens. Bij het aantonen van lange termijn invloeden bieden de effecten van chemische stoffen over generaties in recente studies een nieuw inzicht. Hier beschrijven we protocollen voor het bestuderen van effecten van chemicaliën over meerdere generaties met behulp van vrijlevende nematode Caenorhabditis elegans. Twee aspecten worden gepresenteerd: (1) trans-generationele (TG) en (2) multi-generationele effectstudies, waarvan de laatste is gescheiden voor multi-generationele blootstelling (MGE) en multi-generationele residuele effecten (MGR) effectstudies. De TG-effectstudie is robuust met een eenvoudig doel om te bepalen of chemische blootstelling aan ouders kan resulteren in eventuele resterende gevolgen voor nakomelingen. Nadat de effecten op ouders zijn gemeten, worden natriumhypochloriet oplossingen gebruikt om de ouders te doden en de nakomelingen zo te houden dat de effect meting op de nakomelingen wordt vergemakkelijkt. De TG-effectstudie wordt gebruikt om te bepalen of de nakomelingen worden aangetast wanneer hun ouder aan de verontreinigende stoffen wordt blootgesteld. De MGE en MGR effectstudie is systematisch gebruikt om te bepalen of continue generatie blootstelling kan resulteren in adaptieve reacties bij nakomelingen over generaties. Zorgvuldige pick-up en overdracht worden gebruikt om generaties te onderscheiden om de effect meting van elke generatie te vergemakkelijken. We combineerden ook protocollen voor het meten van bewegingsgedrag, reproductie, levensduur, biochemische en genexpressie veranderingen. Een aantal voorbeeld experimenten worden ook gepresenteerd ter illustratie van de trans-en multi-generationele effectstudies.
Introduction
De toepassing en het afvalbeheer van chemische stoffen is sterk afhankelijk van de informatie over de effecten ervan bij bepaalde concentraties. Met name is tijd een ander essentieel element tussen effecten en concentraties. Dat wil zeggen, chemicaliën, vooral die in lage concentraties in de eigenlijke omgevingen, hebben tijd nodig om meetbare effecten te provoceren1. Daarom regelen onderzoekers verschillende lengtes van de blootstellingsduur in dierproeven en bedekken ze zelfs de hele levenscyclus. Muizen werden bijvoorbeeld blootgesteld aan nicotine voor 30, 90 of 180 dagen om de toxische effecten ervan 2te bestuderen. Toch zijn dergelijke blootstellingsduur nog niet voldoende om de langetermijneffecten van verontreinigende stoffen te verhelderingen (bv. persistente organische verontreinigende stoffen [POPs]) die over generaties van organismen in het milieu kunnen blijven bestaan. Daarom krijgen studies over effecten over generaties steeds meer aandacht.
Er zijn twee belangrijke aspecten in studies voor generationele effecten. De eerste is de trans-generationele (TG) effectstudie die krachtig kan testen of chemische blootstelling aan ouders kan resulteren in eventuele gevolgen voor de nakomelingen3. De tweede is een studie van multi-generationele effecten die systematischer is met overwegingen in zowel blootstelling als residuele effecten. Aan de ene kant worden de effecten met meerdere generationele blootstelling (MGE) gebruikt om adaptieve reacties in de dieren te illustreren aan de langdurige uitdagende omgevingen. Aan de andere kant worden de effecten van multi generationele residuele (MGR) gebruikt om de resterende gevolgen op lange termijn na blootstelling aan te tonen, aangezien de blootstelling van de moeder gepaard gaat met de blootstelling van het embryo aan de eerste nakomelingen en blootstelling aan de kiem lijn aan de tweede nakomelingen die de derde nakomelingen als eerste generatie volledig uit blootstelling4maken.
Hoewel zoogdieren (bijv. muizen) model organismen zijn in toxiciteitsstudies, vooral met betrekking tot mensen, is hun toepassing bij het bestuderen van generatie effecten vrij tijdrovend, duur en ethisch met betrekking tot 5. Dienovereenkomstig bieden organismen, waaronder schaaldieren Daphnia magna6, insect Drosophila melanogaster7 en zebravis Danio rerio8, alternatieve keuzes. Toch hebben deze organismen een gebrek aan gelijkenissen met de mens, of vereisen ze specifieke apparatuur in studies.
Caenorhabditis elegans is een kleine vrijlevende nematode (ongeveer 1 mm lang) met een korte levenscyclus (ongeveer 84 h bij 20 °c)9. Deze nematode deelt vele biologische trajecten conservatief voor de mens, en daarom is het op grote schaal gebruikt om de effecten van verschillende spanningen of Planting10te illustreren. Met name 99,5% van de nematoden zijn hermaphrodites waardoor deze organismen uitermate geschikt zijn voor het bestuderen van generatie effecten, bijvoorbeeld TG-effecten van zware metalen en sulfonamiden3,11, MGE-effecten van gouden nanodeeltjes en zware metalen12 en temperatuur13, Mgr effecten van sulfonamide14, en zowel MGE en Mgr effecten van gammastraling15 en lindaan4. Bovendien zijn er vergelijkbare resultaten gevonden tussen de effecten van chemische stoffen (bv. zearalenon) op de ontwikkeling en reproductie van muizen en C. elegans16,17, die een voordeel zouden bieden voor het extrapoleren van effecten van dit kleine dier op de mens.
Zowel TG en MG effectstudies zijn tijdrovend en moeten zorgvuldig ontwerp en prestaties. Met name bestonden er verschillen in levensfase keuzes, blootstellingsvoorwaarden en generatie scheidingsmethoden in de bovengenoemde studies. Dergelijke verschillen belemmerde de rechtstreekse vergelijking tussen de resultaten en hebben de verdere interpretatie van de resultaten belemmerd. Daarom is het noodzakelijk om uniforme protocollen vast te stellen om TG-en MG-effectenstudies te begeleiden, en ook om een groter beeld te geven om vergelijkbare patronen van verschillende toxicantia of verontreinigende stoffen op langetermijngevolgen te onthullen. Het doel van de huidige protocollen is het aantonen van duidelijke bedrijfsprocessen bij het bestuderen van trans-en multi-generationele effecten met C. elegans. De protocollen zullen ten goede komen aan onderzoekers die geïnteresseerd zijn in het bestuderen van de langetermijneffecten van toxicantia of verontreinigende stoffen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Om het beschreven protocol met succes te kunnen uitvoeren, moet rekening worden gehouden met de volgende suggesties. Voer de algemene experimentele operaties uit in een steriele omgeving. Onjuiste werking kan resulteren in besmetting van de E. coli stammen, bijvoorbeeld, schimmels en mijten kunnen de normale groei van C. elegans belemmeren en dus invloed hebben op de experimentele resultaten. In de sectie die de cultiveren c. elegans beschrijft, observeer je de groei schaal van c. elegans</…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Materials
| agar powder | OXOID, Thermo Fisher Scientific, UK | 9002-18-0 | |
| 79nnHT Fast Real-Time PCR System | Applied Biosystems | ||
| 96-well sterile microplate | Costar，Corning，America | ||
| Autoclave sterilizer | Tomy, Tomy Digital Biology, Japan | ||
| Biosafety cabinet | LongYue, Shanghai longyue instrument equipment co. Ltd, China | ||
| calcium chloride | Sinopharm chemical reagent company Ltd, China | 10043-52-4 | |
| centrifuge 5417R | Eppendorf, Ai Bende (Shanghai) International Trade Co., Ltd, Germany | ||
| Centrifuge tubes | Axygen, Aixjin biotechnology (Hangzhou) co. Ltd, America | ||
| cholesterol | Sinopharm chemical reagent company Ltd, China | 57-88-5 | |
| Dimethyl sulfoxide | VETEC, Sigmar aldrich (Shanghai) trading co. Ltd, America | 67-68-5 | |
| disodium hydrogen phosphate | Sinopharm chemical reagent company Ltd, China | 7558-79-4 | |
| ethanol | Sinopharm chemical reagent company Ltd, China | 64-17-5 | |
| Filter | Thermo, Thermo Fisher Scientific, America | ||
| incubator | YiHeng17, Shanghai yiheng scientific instrument co. Ltd, China | ||
| inoculating loop | |||
| K2HPO4•3H2O | Sinopharm chemical reagent company Ltd, China | 16788-57-1 | |
| kraft paper | |||
| Mcroplate Reader | Boitek, Boten apparatus co. Ltd, America | ||
| MgSO4•7H2O | Sinopharm chemical reagent company Ltd, China | 10034-99-8 | |
| Microscopes XTL-BM-9TD | BM, Shanghai BM optical instruments manufacturing co. Ltd, China | ||
| Petri dishes | |||
| Pipette | Eppendorf, Ai Bende (Shanghai) International Trade Co., Ltd, Germany | ||
| Potassium chloride | Sinopharm chemical reagent company Ltd, China | 7447-40-7 | |
| potassium dihydrogen phosphate | Sinopharm chemical reagent company Ltd, China | 7778-77-0 | |
| Qiagen RNeasy kits | Qiagen Inc., Valencia, CA, United States | ||
| QuantiTect SYBR Green RT-PCR kits | Qiagen Inc., Valencia, CA, United States | ||
| RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit | Thermo Scientific, Wilmington, DE, United States | ||
| sodium chloride | Sinopharm chemical reagent company Ltd, China | 7647-14-5 | |
| sodium hydroxide | Sinopharm chemical reagent company Ltd, China | 1310-73-2 | |
| sodium hypochlorite solution | Aladdin, Shanghai Aladdin biochemical technology co. Ltd, China | 7681-52-9 | |
| tryptone | OXOID, Thermo Fisher Scientific, UK | 73049-73-7 | |
| yeast extract | OXOID, Thermo Fisher Scientific, UK | 119-44-8 |
References
- Yu, Z., Zhang, J., Hou, M. The time-dependent stimulation of sodium halide salts on redox reactants, energy supply and luminescence in Vibrio fischeri. Journal of Hazardous Materials. 342, 429-435 (2018).
- Li, W., et al. Long-term nicotine exposure induces dysfunction of mouse endothelial progenitor cells. Experimental and Therapeutic. 13, 85-90 (2017).
- Yu, Z. Y., Chen, X. X., Zhang, J., Wang, R., Yin, D. Q. Transgenerational effects of heavy metals on L3 larva of Caenorhabditis elegans with greater behavior and growth inhibitions in the progeny. Ecotoxicology and Environmental Safety. 88C, 178-184 (2013).
- Chen, R., Yu, Z., Yin, D. Multi-generational effects of lindane on nematode lipid metabolism with disturbances on insulin-like signal pathway. Chemosphere. 210, 607-614 (2018).
- Van Norman, G. A. A matter of mice and men: ethical issues in animal experimentation. International Anesthesiology Clinics. 53 (3), 63-78 (2015).
- Pereira, C. M. S., Everaert, G., Blust, R., De Schamphelaere, K. A. C. Multigenerational effects of nickel on Daphnia magna depend on temperature and the magnitude of the effect in the first generation. Environmental Toxicology and Chemistry. 37 (7), 1877-1888 (2018).
- Morimoto, J., Simpson, S. J., Ponton, F. Direct and trans-generational effects of male and female gut microbiota in Drosophila melanogaster. Biology Letters. 13, 20160966 (2017).
- Coimbra, A. M., et al. Chronic effects of clofibric acid in zebrafish (Danio rerio): A multigenerational study. Aquatic Toxicology. 160, 76-86 (2015).
- Sugi, T. Genome editing in C. elegans and other nematode species. International Journal of Molecular Sciences. 17, 295 (2016).
- Leung, M. C. K., et al. Caenorhabditis elegans: an emerging model in biomedical and environmental toxicology. Toxicological Science. 106 (1), 5-28 (2008).
- Yu, Z. Y., Jiang, L., Yin, D. Q. Behavior toxicity to Caenorhabditis elegans transferred to the progeny after exposure to sulfamethoxazole at environmentally relevant concentration. Journal of Environmental Sciences-China. 23 (2), 294-300 (2011).
- Kim, S. W., Kwak, J. I., An, Y. J. Multigenerational study of gold nanoparticles in Caenorhabditis elegans: transgenerational effect of maternal exposure. Environmental Science & Technology. 47, 5393-5399 (2013).
- Klosin, A., Casas, E., Hidalgo-Carcedo, C., Vavouri, T., Lehner, B. Transgenerational transmission of environmental information in C. elegans. Science. 356, 320 (2017).
- Yu, Z. Y., et al. Trans-generational influences of sulfamethoxazole on lifespan, reproduction and population growth of Caenorhabditis elegans. Ecotoxicology and Environmental Safety. 135, 312-318 (2017).
- Buisset-Goussen, A., et al. Effects of chronic gamma irradiation: a multigenerational study using Caenorhabditis elegans. Radioactivity. 137, 190-197 (2014).
- Zhao, F., et al. Multigenerational exposure to dietary zearalenone (ZEA), anestrogenic mycotoxin, affects puberty and reproductionin female mice. Reproductive Toxicology. 47, 81-88 (2014).
- Yang, Z., Wang, J., Tang, L., Sun, X., Xue, K. S. Transgenerational comparison of developmental and reproductive toxicities in zearalenone exposed Caenorhabditis elegans. Asian Journal of Ecotoxicology. 11 (4), 61-68 (2016).
- Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis dlegans. Genetics. 77, 71-94 (1974).
- Emmons, S., Klass, M., Hirsch, D. An analysis of the constancy of DNA sequences during development and evolution of the nematode Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76, 1333-1337 (1979).
- Van Gilst, M. R., Hadjivassiliou, H., Yamamoto, K. R. A Caenorhabditis elegans nutrient response system partially dependent on nuclear receptor NHR-49. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (38), 13496-13501 (2005).
- Cobb, E., Hall, J., Palazzolo, D. L. Induction of metallothionein expression after exposure to conventional cigarette smoke but not electronic cigarette (ECIG)-generated aerosol in Caenorhabditis elegans. Frontiers in Physiology. 9, 426 (2018).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-ΔΔCT method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
- Hill, R., et al. Genetic flexibility in the convergent evolution of hermaphroditism in Caenorhabditis Nematodes. Developmental Cell. 10, 531-538 (2006).
- Cabreiro, F., Gems, D. Worms need microbes too: microbiota, health and aging in Caenorhabditis elegans. EMBO Molecular Medicine. 2013, 1300-1310 (2013).
- Breider, F., von Gunten, U. Quantification of total N-nitrosamine concentrations in aqueous samples via UV-photolysis and chemiluminescence detection of nitric oxide. Analytical Chemistry. 89 (3), 1574-1582 (2017).
