Ensayo de inmunoprecipitación de cromatina utilizando nucleasas microcócticas en células de mamíferos
Summary
La inmunoprecipitación por cromatina (ChIP) es una poderosa herramienta para comprender los mecanismos moleculares de la regulación genética. Sin embargo, el método implica dificultades para obtener fragmentación de cromatina reproducible mediante cizallamiento mecánico. Aquí, proporcionamos un protocolo mejorado para un ensayo ChIP usando digestión enzimática.
Abstract
Para expresar fenotipos celulares en los organismos, las células vivas ejecutan la expresión génica en consecuencia, y los programas transcripcionales desempeñan un papel central en la expresión génica. La maquinaria transcripcional celular y sus proteínas de modificación de cromatina se coordinan para regular la transcripción. Para analizar la regulación transcripcional a nivel molecular, están disponibles varios métodos experimentales como el cambio de movilidad electroforética, el reportero transitorio y los ensayos de inmunoprecipitación de cromatina (ChIP). Describimos un ensayo ChIP modificado en detalle en este artículo debido a sus ventajas en mostrar directamente las modificaciones de la histona y las interacciones entre las proteínas y el ADN en las células. Uno de los pasos clave en un ensayo ChIP exitoso es la cizalladura de cromatina. Aunque la sonicación se utiliza comúnmente para el cizallamiento de cromatina, es difícil identificar condiciones reproducibles. En lugar de cizallar cromatina por sonicación, utilizamos digestión enzimática con nucleasa microcócica (MNase) para obtener resultados más reproducibles. En este artículo, proporcionamos un protocolo de ensayo ChIP sencillo usando MNase.
Introduction
La expresión génica en células de mamíferos está regulada de forma estricta y dinámica, y la transcripción es uno de los pasos clave. La transcripción genética está regulada principalmente por factores de transcripción y histonas. Un factor de transcripción es una proteína que se une a secuencias de ADN específicas y controla la transcripción genética. Estos factores promueven o inhiben el reclutamiento de ARN polimerasa II (PolII), que inicia la síntesis de ARNm a partir del ADN genómico como plantilla1. Las modificaciones histonas como la acetilación y la metilación de los residuos de la cola de histona afectan positiva y negativamente a la transcripción del gen cambiando la estructura de la cromatina2. Dado que las alteraciones en la expresión génica afectan al contexto celular, es esencial examinar los mecanismos moleculares por los cuales se regula la transcripción.
Hasta la fecha, se dispone de varios métodos para investigar la regulación de la transcripción genética. El ensayo de cambio de movilidad electroforética (EMSA), también llamado ensayo de cambio de gel, se utiliza para analizar una interacción proteína-ADN3. Un extracto nuclear de células de interés se incuba con una sonda de ADN con etiqueta de isótopo radiactivo (por ejemplo, 32P) y electroforesed en un gel de poliacrilamida. Su autoradiograma muestra que el complejo ADN-proteína migra más lentamente que la sonda en un gel. En presencia de un anticuerpo contra la proteína, el complejo ADN-proteína-anticuerpo migra en un gel más lentamente que el complejo DE proteínas de ADN. Esta banda superimprovisada revela una unión específica entre el ADN y la proteína. Sin embargo, EMSA sólo determina una interacción específica ADN-proteína en un sistema libre de células, y por lo tanto sigue siendo desconocido si la interacción controla la transcripción en células vivas. El ensayo transitorio del reportero, comúnmente llamado ensayo de reportero luciferasa, fue desarrollado para abordar la regulación de la expresión génica en las células. Por lo general, una región genómica ascendente de un genal de interés se inserta en un plásmido reportero, transfectó transitoriamente en las células, y se mide la actividad del reportero. Una variedad de mutantes de eliminación permite la identificación de las regiones que son responsables de la regulación genética. A pesar de que un ensayo de reportero es una herramienta útil para identificar factores de transcripción y unir secuencias de ADN que controlan la transcripción, este método tiene una desventaja importante en que un plásmido reportero está libre de estructura de cromatina y no refleja “real” maquinaria de transcripción. Además, el sistema no puede determinar los cambios en las modificaciones de histono.
El desarrollo del método de inmunoprecipitación de cromatina (ChIP) se basó en los informes de Jackson y Chalkley de que la fijación de “células enteras” con la estructura de cromatina preservada con formaldehído4,5. Desde entonces, muchas técnicas relacionadas se han desarrollado y mejorado6. En los ensayos de ChIP, las células se fijan con formaldehido para cruzar el ADN y las proteínas. La cromatina se fragmenta y luego se inmunoprecia con anticuerpos de interés. El complejo inmunológico se lava y se purifica el ADN. La amplificación de PCR con imprimaciones dirigidas a una región particular del genoma revela la ocupación de proteínas de interés en el genoma.
Aunque ChIP es una poderosa herramienta para identificar las interacciones de proteínas como factores de transcripción y histonas modificadas con el ADN, el método implica algunas dificultades, como un paso de fragmentación de la cromatina, en la práctica. La sonicación ha sido ampliamente utilizada para el cizallamiento de cromatina; sin embargo, es engorroso identificar condiciones reproducibles. El tratamiento de la nucleasa microcócica (MNase) es un método alternativo para la cizalladura de cromatina. MNase es una endo-exonucleasa que digiere ADN y ARN de doble cadena, de una sola cadena, circular y lineal. Es relativamente fácil determinar las condiciones, incluyendo las cantidades de cromatina y enzima, temperatura y tiempo de incubación, para una fragmentación óptima de la cromatina. Modificamos y simplificamos los protocolos existentes, y establecimos un método sencillo y reproducible. Este documento proporciona el protocolo para un ensayo ChIP utilizando MNase en células de mamíferos.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aunque la sonicación se utiliza comúnmente para obtener cromatina fragmentada, es lento y engorroso identificar condiciones reproducibles. En este protocolo, utilizamos la digestión MNase porque la digestión enzimática debería ser más fácil de identificar condiciones reproducibles. Un breve paso de sonicación después de la digestión de la MNase (ver paso 2.2) fue necesario para romper la membrana celular y liberar la cromatina digerida. Por lo tanto, el poder de sonicación en nuestro protocolo debe ser lo má…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Esta investigación es apoyada por las regalías de Genentech a la Ciudad de la Esperanza. Este trabajo no es apoyado total o parcialmente por los Institutos Nacionales de Salud.
Materials
| 0.5 M EDTA (pH 8.0) | Thermo Scientific | AM9010 | |
| 2 M KCl | Thermo Scientific | AM9010 | |
| 2X iQ SYBR Green supermix | Bio-Rad | 1706862 | |
| 5 M NaCl | Thermo Scientific | AM9010 | |
| 50 bp DNA ladder | New England Biolabs | N3236S | |
| Agarose | Research Product International | A20090 | |
| Branched octylphenoxy poly(ethyleneoxy)ethanol | Millipore Sigma | I8896 | IGEPAL CA-630 |
| ChIP-grade protein G magnetic beads | Cell signaling technology | 9006S | |
| Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) Dilution Buffer | Millipore Sigma | 20-153 | Buffer composition: 0.01% SDS, 1.1% Triton X- 100, 1.2mM EDTA, 16.7mM Tris-HCl, pH 8.1, 167mM NaCl. |
| Gel Loading Dye Purple (6X) | New England Biolabs | B7024S | |
| Glycine | Bio-Rad | 161-0724 | Electropheresis grade |
| Glycogen | Millipore Sigma | G1767 | 19-22 mg/mL |
| Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail, EDTA-free (100x) | Thermo Scientific | 78445 | |
| High Salt Immune Complex Wash Buffer | Millipore Sigma | 20-155 | Buffer composition: 0.1% SDS, 1% Triton X-100, 2mM EDTA, 20mM Tris-HCl, pH 8.1, 500mM NaCl. |
| Histone H3K4me3 antibody (pAb) | Active Motif | 39915 | |
| LiCl Immune Complex Wash Buffer | Millipore Sigma | 20-156 | Buffer composition: 0.25M LiCl, 1% IGEPAL CA630, 1% deoxycholic acid (sodium salt), 1mM EDTA, 10mM Tris, pH 8.1. |
| Low Salt Immune Complex Wash Buffer | Millipore Sigma | 20-154 | Buffer composition: 0.1% SDS, 1% Triton X-100, 2mM EDTA, 20mM Tris-HCl, pH 8.1, 150mM NaCl. |
| Magna GrIP Rack (8 well) | Millipore Sigma | 20-400 | Any kind of magnetic separation stands that are compatible with a 1.5 mL tube is fine. |
| Micrococcal nuclease | New England Biolabs | M0247S | comes with 10 x buffer (500 mM Tris-HCl, 50 mM CaCl2, pH 7.9 @ 25 °C) and 100 x BSA (10 mg/ml) |
| NaHCO3 | JT Baker | 3506-01 | |
| Normal rabbit IgG | Millipore Sigma | 12-370 | |
| PIPES | Millipore Sigma | P6757 | |
| Proteinase K | Millipore Sigma | 3115887001 | |
| Real-time PCR system | Bio-Rad | CFX96, C1000 | |
| RNA pol II CTD phospho Ser5 antibody | Active Motif | 39749 | |
| SDS | Boehringer Mannheim | 100155 | Electropheresis grade |
| sodium acetate | Millipore Sigma | S5636 | |
| Sonicator equipped with a microtip probe | QSONICA | Q700 | Any kind of sonicators that are compatible with a 1.5 mL tube is fine. |
| UltraPure Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol (25:24:1, v/v) | Thermo Scientific | 15593031 | pH 8.05 |
References
- Nikolov, D. B., Burley, S. K. RNA polymerase II transcription initiation: a structural view. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (1), 15-22 (1997).
- Strahl, B. D., Allis, C. D. The language of covalent histone modifications. Nature. 403 (6765), 41-45 (2000).
- Hellman, L. M., Fried, M. G. Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) for detecting protein-nucleic acid interactions. Nature protocols. 2 (8), 1849-1861 (2007).
- Jackson, V., Chalkley, R. Use of whole-cell fixation to visualize replicating and maturing simian virus 40: identification of new viral gene product. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 78 (10), 6081-6085 (1981).
- Jackson, V., Chalkley, R. A new method for the isolation of replicative chromatin: selective deposition of histone on both new and old DNA. Cell. 23 (1), 121-134 (1981).
- Collas, P. The current state of chromatin immunoprecipitation. Molecular Biotechnology. 45 (1), 87-100 (2010).
- Ausubel, R. B., Kingston, R. E., Moore, D. D., Smith, J. A., Struhl, K. Preparation of Genomic DNA. Short Protocols in Molecular Biology. , (1992).
- Crouse, J., Amorese, D. Ethanol Precipitation: Ammonium Acetate as an Alternative to Sodium Acetate. Focus. 9 (2), 3-5 (1987).
- Zeugin, J. A., Hartley, J. L. Ethanol Precipitation of DNA. Focus. 7 (4), 1-2 (1985).
- Barski, A., et al. High-resolution profiling of histone methylations in the human genome. Cell. 129 (4), 823-837 (2007).
- Guenther, M. G., Levine, S. S., Boyer, L. A., Jaenisch, R., Young, R. A. A chromatin landmark and transcription initiation at most promoters in human cells. Cell. 130 (1), 77-88 (2007).
- Louie, M. C., et al. Androgen-induced recruitment of RNA polymerase II to a nuclear receptor-p160 coactivator complex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (5), 2226-2230 (2003).
- Liu, X., et al. Positive feedback loop mediated by protein phosphatase 1alpha mobilization of P-TEFb and basal CDK1 drives androgen receptor in prostate cancer. Nucleic Acids Research. 45 (7), 3738-3751 (2017).
- Zhao, H., et al. Identification of valid reference genes for mRNA and microRNA normalisation in prostate cancer cell lines. Scientific reports. 8 (1), 1949 (2018).
- Nelson, J. D., Denisenko, O., Bomsztyk, K. Protocol for the fast chromatin immunoprecipitation (ChIP) method. Nature. 1 (1), 179-185 (2006).
- Gade, P., Kalvakolanu, D. V. Chromatin immunoprecipitation assay as a tool for analyzing transcription factor activity. Methods in molecular biology. 809, 85-104 (2012).
- Lund, E. G., Duband-Goulet, I., Oldenburg, A., Buendia, B., Collas, P. Distinct features of lamin A-interacting chromatin domains mapped by ChIP-sequencing from sonicated or micrococcal nuclease-digested chromatin. Nucleus. 6 (1), 30-39 (2015).
- Dahl, J. A., Collas, P. A rapid micro chromatin immunoprecipitation assay (microChIP). Nature protocols. 3 (6), 1032-1045 (2008).
- Yamakawa, T., Waer, C., Itakura, K. AT-rich interactive domain 5B regulates androgen receptor transcription in human prostate cancer cells. Prostate. 78 (16), 1238-1247 (2018).
