Kromatin immunoprecipitation analys med hjälp av Micrococcal nukleaser i däggdjursceller
Summary
Kromatin immunoprecipitation (ChIP) är ett kraftfullt verktyg för att förstå de molekylära mekanismerna för genreglering. Metoden innebär dock svårigheter att få reproducerbar kromatinfragmentering genom mekanisk klippning. Här ger vi ett förbättrat protokoll för en ChIP-analys med enzymatisk matsmältning.
Abstract
För att uttrycka cellulära fenotyper i organismer, levande celler utföra genuttryck i enlighet därmed, och transkriptionella program spelar en central roll i genuttryck. Den cellulära transcriptionella maskiner och dess kromatin modifiering proteiner samordna för att reglera transkription. För att analysera transkriptionell reglering på molekylär nivå finns flera experimentella metoder såsom elektroforetisk rörlighet Skift, övergående reporter och kromatin immunoprecipitation (ChIP) analyser. Vi beskriver en modifierad chip analys i detalj i denna artikel på grund av dess fördelar i direkt visar Histon modifieringar och samspelet mellan proteiner och DNA i celler. En av de viktigaste stegen i en lyckad ChIP-analys är kromatin klippning. Även ultraljudsbehandling används ofta för klippning kromatin, det är svårt att identifiera reproducerbara förhållanden. Istället för klippning kromatin av ultraljudsbehandling, utnyttjade vi enzymatisk matsmältning med micrococcal Nuclease (mnase) för att få mer reproducerbara resultat. I den här artikeln ger vi en enkel ChIP assay protokoll med MNase.
Introduction
Genuttryck i däggdjursceller är tätt och dynamiskt reglerad, och transkription är en av de viktigaste stegen. Gentranskription regleras huvudsakligen av transkriptionsfaktorer och histones. En transkriptionsfaktor är ett protein som binder till specifika DNA-sekvenser och kontrollerar gentranskription. Dessa faktorer antingen främja eller hämma rekryteringen av RNA-polymeras II (polii), som initierar mRNA syntes från genomisk DNA som mall1. Histonmodifikationer såsom acetylering och metylering av histonstjärtrester positivt och negativt påverka gentranskription genom att ändra kromatin struktur2. Eftersom förändringar i genuttryck påverkar det cellulära sammanhanget är det viktigt att undersöka de molekylära mekanismer genom vilka transkription regleras.
Hittills finns det flera metoder för att undersöka regleringen av gentranskription. Electrophoretic Mobility Shift assay (EMSA), även kallad en gel Skift analys, används för att analysera en protein-DNA interaktion3. Ett kärn extrakt från celler av intresse inkuberas med en radioaktiv isotop (till exempel 32P)-märkt DNA-sond och electrophoresed på en polyakrylamidgel. Dess autoradiogram visar att DNA-proteinkomplexet migrerar långsammare än sonden i en gel. I närvaro av en antikropp mot proteinet, DNA-protein-antikroppskomplexet migrerar i en gel långsammare än DNA-proteinkomplexet. Detta superskiftade band avslöjar specifik bindning mellan DNA och protein. Emellertid, EMSA endast bestämmer en specifik DNA-proteininteraktion i ett cellfritt system, och därför är det fortfarande okänt om interaktionen styr transkription i levande celler. Transitorisk reporter analys, vanligen kallad luciferas reporter assay, utvecklades för att hantera gen uttrycks reglering i celler. Typiskt, en uppströms genomisk region av en gen av intresse sätts in i en reporter plasmid, transitivt transfekterade i celler, och reporter aktiviteten mäts. En mängd olika raderingsmutanter gör det möjligt att identifiera regioner som är ansvariga för genreglering. Även om en reporter analys är ett användbart verktyg för att identifiera transkriptionsfaktorer och bindande DNA-sekvenser kontrollera transkription, denna metod har en stor nackdel i att en reporter plasmid är fri från kromatin struktur och inte återspeglar “riktiga” maskiner för transkription. Dessutom kan ändringar i histonmodifieringar inte bestämmas av systemet.
Utvecklingen av kromatin immunoprecipitation (chip) metoden baserades på Jackson och chalkley rapporter att “hela cellen” fixering med formaldehyd bevarade kromatin struktur4,5. Sedan dess har många relaterade tekniker utvecklats och förbättrats6. I Spånanalyser fixeras celler med formaldehyd för att korslänka DNA och proteiner. Den kromatin är fragmenterad och sedan immunopreciated med antikroppar av intresse. Immun komplexet tvättas och DNA renas. PCR-förstärkning med primers riktade till en viss region av genomet avslöjar beläggning av proteiner av intresse i genomet.
Även chip är ett kraftfullt verktyg för att identifiera samspelet mellan proteiner som transkriptionsfaktorer och modifierade histoner med DNA, metoden innebär vissa svårigheter, såsom en kromatin fragmentering steg, i praktiken. Ultraljudsbehandling har ofta används för klippning kromatin; Det är dock besvärligt att identifiera reproducerbara förhållanden. Micrococcal Nuclease (MNase) behandling är en alternativ metod för kromatin klippning. MNase är en endo-exonukleas som smälter dubbelsträngad, enkelsträngad, cirkulär och linjär DNA och RNA. Det är relativt lätt att bestämma villkoren, inklusive mängden kromatin och enzym, temperatur, och inkubering tid, för optimal kromatin fragmentering. Vi ändrade och förenklade de befintliga protokollen, och vi etablerade en enkel och reproducerbar metod. Detta dokument innehåller protokollet för en ChIP-analys med hjälp av MNase i däggdjursceller.
Protocol
Representative Results
Discussion
Även ultraljudsbehandling används ofta för att få fragmenterad kromatin, det är tidskrävande och besvärligt att identifiera reproducerbara förhållanden. I detta protokoll, vi använde MNase matsmältning eftersom enzym nedbrytning bör vara lättare att identifiera reproducerbara villkor. En kort ultraljudsbehandling steg efter MNase matsmältning (se steg 2,2) var nödvändigt att bryta cellmembranet och att frigöra den smälta kromatin. Därför bör ultraljudsbehandling makten i vårt protokoll vara så låg…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denna forskning stöds av Genentech royalties till City of Hope. Detta arbete stöds inte helt eller delvis av National Institutes of Health.
Materials
| 0.5 M EDTA (pH 8.0) | Thermo Scientific | AM9010 | |
| 2 M KCl | Thermo Scientific | AM9010 | |
| 2X iQ SYBR Green supermix | Bio-Rad | 1706862 | |
| 5 M NaCl | Thermo Scientific | AM9010 | |
| 50 bp DNA ladder | New England Biolabs | N3236S | |
| Agarose | Research Product International | A20090 | |
| Branched octylphenoxy poly(ethyleneoxy)ethanol | Millipore Sigma | I8896 | IGEPAL CA-630 |
| ChIP-grade protein G magnetic beads | Cell signaling technology | 9006S | |
| Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) Dilution Buffer | Millipore Sigma | 20-153 | Buffer composition: 0.01% SDS, 1.1% Triton X- 100, 1.2mM EDTA, 16.7mM Tris-HCl, pH 8.1, 167mM NaCl. |
| Gel Loading Dye Purple (6X) | New England Biolabs | B7024S | |
| Glycine | Bio-Rad | 161-0724 | Electropheresis grade |
| Glycogen | Millipore Sigma | G1767 | 19-22 mg/mL |
| Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail, EDTA-free (100x) | Thermo Scientific | 78445 | |
| High Salt Immune Complex Wash Buffer | Millipore Sigma | 20-155 | Buffer composition: 0.1% SDS, 1% Triton X-100, 2mM EDTA, 20mM Tris-HCl, pH 8.1, 500mM NaCl. |
| Histone H3K4me3 antibody (pAb) | Active Motif | 39915 | |
| LiCl Immune Complex Wash Buffer | Millipore Sigma | 20-156 | Buffer composition: 0.25M LiCl, 1% IGEPAL CA630, 1% deoxycholic acid (sodium salt), 1mM EDTA, 10mM Tris, pH 8.1. |
| Low Salt Immune Complex Wash Buffer | Millipore Sigma | 20-154 | Buffer composition: 0.1% SDS, 1% Triton X-100, 2mM EDTA, 20mM Tris-HCl, pH 8.1, 150mM NaCl. |
| Magna GrIP Rack (8 well) | Millipore Sigma | 20-400 | Any kind of magnetic separation stands that are compatible with a 1.5 mL tube is fine. |
| Micrococcal nuclease | New England Biolabs | M0247S | comes with 10 x buffer (500 mM Tris-HCl, 50 mM CaCl2, pH 7.9 @ 25 °C) and 100 x BSA (10 mg/ml) |
| NaHCO3 | JT Baker | 3506-01 | |
| Normal rabbit IgG | Millipore Sigma | 12-370 | |
| PIPES | Millipore Sigma | P6757 | |
| Proteinase K | Millipore Sigma | 3115887001 | |
| Real-time PCR system | Bio-Rad | CFX96, C1000 | |
| RNA pol II CTD phospho Ser5 antibody | Active Motif | 39749 | |
| SDS | Boehringer Mannheim | 100155 | Electropheresis grade |
| sodium acetate | Millipore Sigma | S5636 | |
| Sonicator equipped with a microtip probe | QSONICA | Q700 | Any kind of sonicators that are compatible with a 1.5 mL tube is fine. |
| UltraPure Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol (25:24:1, v/v) | Thermo Scientific | 15593031 | pH 8.05 |
References
- Nikolov, D. B., Burley, S. K. RNA polymerase II transcription initiation: a structural view. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (1), 15-22 (1997).
- Strahl, B. D., Allis, C. D. The language of covalent histone modifications. Nature. 403 (6765), 41-45 (2000).
- Hellman, L. M., Fried, M. G. Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) for detecting protein-nucleic acid interactions. Nature protocols. 2 (8), 1849-1861 (2007).
- Jackson, V., Chalkley, R. Use of whole-cell fixation to visualize replicating and maturing simian virus 40: identification of new viral gene product. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 78 (10), 6081-6085 (1981).
- Jackson, V., Chalkley, R. A new method for the isolation of replicative chromatin: selective deposition of histone on both new and old DNA. Cell. 23 (1), 121-134 (1981).
- Collas, P. The current state of chromatin immunoprecipitation. Molecular Biotechnology. 45 (1), 87-100 (2010).
- Ausubel, R. B., Kingston, R. E., Moore, D. D., Smith, J. A., Struhl, K. Preparation of Genomic DNA. Short Protocols in Molecular Biology. , (1992).
- Crouse, J., Amorese, D. Ethanol Precipitation: Ammonium Acetate as an Alternative to Sodium Acetate. Focus. 9 (2), 3-5 (1987).
- Zeugin, J. A., Hartley, J. L. Ethanol Precipitation of DNA. Focus. 7 (4), 1-2 (1985).
- Barski, A., et al. High-resolution profiling of histone methylations in the human genome. Cell. 129 (4), 823-837 (2007).
- Guenther, M. G., Levine, S. S., Boyer, L. A., Jaenisch, R., Young, R. A. A chromatin landmark and transcription initiation at most promoters in human cells. Cell. 130 (1), 77-88 (2007).
- Louie, M. C., et al. Androgen-induced recruitment of RNA polymerase II to a nuclear receptor-p160 coactivator complex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (5), 2226-2230 (2003).
- Liu, X., et al. Positive feedback loop mediated by protein phosphatase 1alpha mobilization of P-TEFb and basal CDK1 drives androgen receptor in prostate cancer. Nucleic Acids Research. 45 (7), 3738-3751 (2017).
- Zhao, H., et al. Identification of valid reference genes for mRNA and microRNA normalisation in prostate cancer cell lines. Scientific reports. 8 (1), 1949 (2018).
- Nelson, J. D., Denisenko, O., Bomsztyk, K. Protocol for the fast chromatin immunoprecipitation (ChIP) method. Nature. 1 (1), 179-185 (2006).
- Gade, P., Kalvakolanu, D. V. Chromatin immunoprecipitation assay as a tool for analyzing transcription factor activity. Methods in molecular biology. 809, 85-104 (2012).
- Lund, E. G., Duband-Goulet, I., Oldenburg, A., Buendia, B., Collas, P. Distinct features of lamin A-interacting chromatin domains mapped by ChIP-sequencing from sonicated or micrococcal nuclease-digested chromatin. Nucleus. 6 (1), 30-39 (2015).
- Dahl, J. A., Collas, P. A rapid micro chromatin immunoprecipitation assay (microChIP). Nature protocols. 3 (6), 1032-1045 (2008).
- Yamakawa, T., Waer, C., Itakura, K. AT-rich interactive domain 5B regulates androgen receptor transcription in human prostate cancer cells. Prostate. 78 (16), 1238-1247 (2018).
