Ubiqitinering er en post-translational modifikasjon som spiller viktige roller i cellulære prosesser og er tett koordinert av deubiquitination. Defekter i begge reaksjonene ligger til grunn menneskelige patologi. Vi tilbyr protokoller for å gjennomføre ubiqitinering og deubiquitination reaksjon in vitro ved hjelp av renset komponenter.
Ubiqitinering er en post-translational modifikasjon som spiller viktige roller i ulike signalering veier og er spesielt involvert i samordning av kromatin funksjon og DNA-assosiert prosesser. Denne endringen innebærer en sekvensiell handling av flere enzymer inkludert E1 ubiquitin-aktivering, E2 ubiquitin-bøye og E3 ubiquitin-ligase og reverseres av deubiquitinases (DUBs). Ubiqitinering induserer degradering av proteiner eller endring av protein funksjon inkludert modulering av enzymatisk aktivitet, protein-protein interaksjon og subcellulære lokalisering. Et kritisk skritt i å demonstrere protein ubiqitinering eller deubiquitination er å utføre in vitro reaksjoner med renset komponenter. Effektive ubiqitinering og deubiquitination reaksjoner kan bli sterkt påvirket av de ulike komponentene som brukes, enzym co-faktorer, buffer forhold, og arten av underlaget. Her gir vi trinn-for-trinn protokoller for å gjennomføre ubiqitinering og deubiquitination reaksjoner. Vi illustrerer disse reaksjonene ved hjelp av minimale komponenter av musen Polycomb undertrykkende Complex 1 (PRC1), BMI1, og RING1B, en E3 ubiquitin ligase som monoubiquitinates histone H2A på lysin 119. Deubiquitination av nucleosomal H2A utføres ved hjelp av en minimal Polycomb undertrykkende Deubiquitinase (PR-DUB) kompleks dannet av den menneskelige Deubiquitinase BAP1 og DEUBiquitinase adapter (DEUBAD) domenet til co-Factor ASXL2. Disse ubiqitinering/deubiquitination analysene kan gjennomføres i sammenheng med enten rekombinant nucleosomes tilberedt med bakterier-renset proteiner eller innfødte nucleosomes renset fra pattedyrceller. Vi fremhever vanskelighetene som kan ha en betydelig innvirkning på disse reaksjonene, og vi foreslår at de generelle prinsippene for disse protokollene raskt kan tilpasses andre E3-ubiquitin ligases og deubiquitinases.
Ubiqitinering er en av de mest bevarte post-translational modifikasjoner og er avgjørende for et bredt spekter av organismer, inkludert gjær, planter og virveldyr. Ubiqitinering består av kovalente feste av ubiquitin, en svært bevart 76 aminosyre polypeptid, å målrette proteiner og forekommer i tre sekvensielle trinn som involverer tre enzymer, dvs., E1-aktivering, E2-bøye og E3 ligase1, 2,3. Dette post-translational modifikasjon spiller sentrale roller i et bredt spekter av biologiske prosesser. Faktisk er E3 ligases, som gir spesifisitet av reaksjonen, utgjør en stor overfamilie av enzymer og er de mest tallrike enzymer i ubiquitin system4,5,6. Den nedstrøms effekten av protein ubiqitinering avhenger av innholdet i endringen: monoubiquitination, multi-monoubiquitination, og lineær eller utvidet polyubiquitination. Monoubiquitination er sjelden forbundet med proteasomal degradering, men i stedet denne endringen er involvert i formidling ulike signalnettverk hendelser. Polyubiquitination involverer N-Terminal eller lysin rester i ubiquitin molekyl selv, og skjebnen til en polyubiquitinated protein avhenger av hvilke rester er involvert i ubiquitin kjeden forlengelse. Det har lenge vært kjent at polyubiquitination formidlet av lysin 48 av ubiquitin induserer proteasomal degradering. Tvert imot, polyubiquitination via lysin 63 av ubiquitin er ofte forbundet med protein aktivisering7,8,9. I likhet med andre viktige post-translational modifikasjoner, ubiqitinering er reversibel og ubiquitin fjerning av proteiner er sikret ved spesifikk proteaser betegnes deubiquitinases (DUBs), som har dukket opp som viktige regulatorer av cellulære prosesser 2 andre priser , 10. viktigere, mange DUBs er høyt spesialiserte, og regulerer gjennom deubiquitination, spesifikke underlag, noe som indikerer at en fin balanse mellom ubiqitinering og deubiquitination er kritisk for protein funksjon. E3s og DUBs, sammen med proteasomet ned brytnings maskiner og tilbehørs faktorer, danner Ubiquitin Proteasomet system (UPS, med > 1200 gener) som regulerer store signal veier, hvorav flere er forbundet med cellevekst og spredning, celle skjebne besluttsomhet, differensiering, celle migrasjon, og celle død. Viktigere, dereguleringen av flere signalering kaskader involverer ubiqitinering fremmer tumorigenesis og neurodegeneration sykdommer5,11,12,13, 14i det.
Ubiqitinering spiller gjennomgripende roller i kromatin biologi og DNA-avhengige prosesser15,16,17. For eksempel, monoubiquitination av histone H2A på lysin 119 (heretter H2A K119ub) er en kritisk post-translational modifikasjon involvert i transcriptional undertrykkelse og DNA reparasjon18,19,20, 21,22. H2A K119ub er katalysert av Polycomb undertrykkende Complex 1 (PRC1), som spiller en nøkkelrolle i opprettholdelsen av epigenetic informasjon og er svært bevart fra Drosophila til mennesker. Kanonisk PRC1 er konstituert spesielt av RING1B og BMI1, som er kjernen E3 ubiquitin ligase kompleks ansvarlig for ovennevnte ubiqitinering hendelse22,23. I Drosophila, H2A MONOUBIQUITINATION (H2A K118ub som tilsvarer H2A K119ub i mammalians) er reversert av dub Calypso, som samhandler med ytterligere sex kam (ASX) danner Polycomb-undertrykkende dub (pr-DUB) kompleks24. Pattedyr ortholog av Calypso, BAP1, er en svulst Suppressor slettet eller deaktivert i ulike menneskelige ondartet25,26,27,28, 29 flere , 30 priser og , 31 andre , 32 for alle , 33. BAP1 regulerer DNA-avhengige prosesser i kjernen og kalsium-signalering-mediert apoptose på endoplasmatiske retikulum33,34,35,36, 37 for alle , 38 for alle , 39 for alle , 40 for alle , 41 for alle , 42. BAP1 samler multi-delenhet protein komplekser inneholder transkripsjon regulatorer spesielt ASXL1, ASXL2 og ASXL3 (ASXLs), tre orthologues av ASX38,43. ASXLs bruke DEUBiquitinase adapter (DEUBAD) domene, også kalt ASXM domene, for å stimulere BAP1 dub aktivitet35,36,44. Derfor ASXLs spille viktige roller i å koordinere BAP1 DUB aktivitet på kromatin og mer generelt sin tumor Suppressor funksjon.
Det finnes flere metoder for å studere ubiqitinering og deubiquitination prosesser. Biokjemiske analyser som bruker proteiner renset fra bakterier er fortsatt svært kraftige i å demonstrere direkte ubiqitinering av, eller fjerning av ubiquitin fra, spesifikke underlag. Disse eksperimentene kan gjennomføres for å undersøke en rekke parametre som å bestemme kravet om minimale komplekser, bestemme reaksjoner Kinetics, definere struktur/funksjon relasjoner, og forstå virkningen av patologisk genmutasjoner. Her gir vi protokoller for å gjennomføre ubiqitinering og deubiquitination reaksjoner på kromatin underlag med renset komponenter. Som et modell system, in vitro ubiqitinering og deubiquitination av nucleosomal H2A protein er presentert. Bakterier-renset proteiner montert i minimale komplekser av RING1B/BMI1 og BAP1/DEUBAD brukes for ubiqitinering eller deubiquitination av nucleosomal H2A, henholdsvis.
Det er flere fordeler ved å etablere robuste in vitro ubiqitinering og deubiquitination analyser for proteiner av interesse. Disse analysene kan brukes til å: (i) etablere optimale forhold og definere minimale krav til disse reaksjonene, (II) bestemme enzymatisk kinetisk og biokjemiske konstanter, (III) definere rollene til kofaktorer eller hemmere som kan påvirke disse reaksjonene, (IV) identifisere interaksjon grensesnitt, (v) teste effekten av kunstige eller sykdom-tilknyttede mutasjoner og (vi) etablere analysen f…
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Diana Adjaoud for teknisk assistanse. Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra Natural Sciences og engineering Research Council of Canada (2015-2020), Genova Quebec (2016-2019) og Genova Canada (2016-2019) til E.B.A. E.B.A. er seniorforsker i fonds de la Recherche du Québec-santé (FRQ-S). L. M og N.S.K. har et doktorgradsstipend fra FRQ-S. H. B hadde et doktorgradsstipend fra departementet for høyere utdanning og fra Scientific Research i Tunisia og Cole Foundation.
Amylose agarose beads | New England Biolabs | #E8021 | |
Amicon Ultra 0.5 ml centrifugal filters 10K | Sigma-Aldrich | #UFC501096 | |
Anti-H2AK119ub (H2Aub) | Cell Signaling Technology | #8240 | |
Anti-Flag-agarose beads | Sigma-Aldrich | #A4596 | |
Anti-protease cocktail | Sigma-Aldrich | #P8340 | |
BL21 (DE3) CodonPlus-RIL bacteria | Agilent technologies | #230240 | |
DMEM | Wisent | #319-005-CL | |
Empty chromatography column | Biorad | #731-1550 | |
Flag peptide | Sigma-Aldrich | #F3290 | |
GSH-agarose beads | Sigma-Aldrich | #G4510 | |
HEK293T | ATCC | #CRL-3216 | |
Imidazole | Sigma-Aldrich | #I5513 | |
Micrococcal nuclease (MNase) | Sigma-Aldrich | #N3755 | |
Ni-NTA agarose beads | ThermoFisher Scientific | #88221 | |
N-methylmaleimide (NEM) | Bioshop | #ETM222 | |
Pore syringe filter 0.45 μm | Sarstedt | #83.1826 | |
Polyethylenimine (PEI) | Polysciences Inc | #23966-1 | |
pGEX6p2rbs-GST-RING1B(1-159)-Bmi1(1-109) | Addgene | #63139 | |
Ub Activating Enzyme (UBE1) | Boston Biochem | #E-305 | |
UBCH5C (UBE2D3) | Boston Biochem | #E2-627 |