In Vitro Ubiquitination e Deubiquitination Saggi di Istoni Nucleosomici
Summary
L’ubiquitinazione è una modifica post-traduzionale che svolge un ruolo importante nei processi cellulari ed è strettamente coordinata dalla deubiquitinazione. I difetti in entrambe le reazioni sono alla base delle patologie umane. Forniamo protocolli per condurre l’ubiquitinazione e la reazione di deubiquitinazione in vitro utilizzando componenti purificati.
Abstract
L’ubiquitinazione è una modifica post-traduzionale che svolge un ruolo importante in vari percorsi di segnalazione ed è particolarmente coinvolta nel coordinamento della funzione della cromatina e dei processi associati al DNA. Questa modifica comporta un’azione sequenziale di diversi enzimi, tra cui E1 ubiquitin-activating, E2 ubiquitin-conjuging e E3 ubiquitin-ligase ed è invertita da deubiquitinaes (DUB). L’ubiquitinazione induce la degradazione delle proteine o l’alterazione della funzione proteica, compresa la modulazione dell’attività enzimatica, l’interazione proteina-proteina e la localizzazione subcellulare. Un passo fondamentale nella dimostrazione dell’ubiquitinazione proteica o della deubiquitinazione è quello di eseguire reazioni in vitro con componenti purificati. Un’efficace ubiquitinazione e reazioni di deubiquitinazione potrebbero essere fortemente influenzate dai diversi componenti utilizzati, dai co-fattori enzimatici, dalle condizioni di buffer e dalla natura del substrato. Qui, forniamo protocolli passo-passo per condurre reazioni di ubiquitinazione e deubiquitinazione. Illustriamo queste reazioni utilizzando componenti minimi del mouse Polycomb Repressive Complex 1 (PRC1), BMI1, e RING1B, un E3 ubiquitin ligase che monoubiquizza istone H2A sulla lisina 119. La deubiquitinazione del nucleosomal H2A viene eseguita utilizzando un complesso minimo Polycomb Repressive Deubiquitinase (PR-DUB) formato dal deubiquitinase BAP1 umano e dal dominio DEUBiquitinase ADaptor (DEUBAD) del suo co-fattore ASXL2. Questi saggi di ubiquitinazione/deubiquitinazione possono essere condotti nel contesto di nucleosomi ricombinanti ricostituiti con proteine purificate dai batteri o nucleosomi nativi purificati dalle cellule dei mammiferi. Mettiamo in evidenza la complessità che può avere un impatto significativo su queste reazioni e proponiamo che i principi generali di questi protocolli possano essere rapidamente adattati ad altri legamenti e deubiquitinasi E3.
Introduction
L’ubiquitinazione è una delle modifiche post-traduzionali più conservate ed è fondamentale per un’ampia varietà di organismi, tra cui lievito, piante e vertebrati. L’ubiquitinazione consiste nell’attaccamento covalente dell’ubiquitina, un polipeptide da 76 amminoacidi altamente conservato, per colpire le proteine e si verifica in tre fasi sequenziali che coinvolgono tre enzimi, vale a dire, l’attivazione di E1, la coniugazione E2 e la ligase1: 2,3. Questa modifica post-traduzionale svolge un ruolo centrale in un ampio spettro di processi biologici. Infatti, i legamenti E3, che forniscono la specificità della reazione, costituiscono una grande superfamiglia di enzimi e sono gli enzimi più abbondanti del sistema di ubiquitina4,5,6. Gli effetti a valle dell’ubiquitinazione proteica dipendono dalla natura della modificazione: monoubiquitinazione, multimonoscanto e poliubiquitinazione lineare o ramificata. La monoubiquitinazione è raramente associata alla degradazione proteasomica, ma questa modifica è coinvolta nella mediazione di vari eventi di segnalazione. La poliubiquitinazione coinvolge i residui di lisina o di lisina nella molecola di ubiquitina stessa, e il destino di una proteina poliubificata dipende da quale residuo è coinvolto nell’estensione della catena di ubiquitina. È noto da tempo che la poliubiquitinazione mediata dalla lisina 48 dell’ubiquitina induce la degradazione proteasomica. Al contrario, la poliubiquitinazione via lisina 63 di ubiquitina è spesso associata all’attivazione della proteina7,8,9. Simile ad altre importanti modifiche post-traduzionali, l’ubiquitinazione è reversibile e la rimozione dell’ubiquitina dalle proteine è garantita da proteasi specifici rivolte deubiquitinase (DUB), che sono emerse come importanti regolatori dei processi cellulari 2 Il nome del sistema , 10. È importante sottolineare che molti DUB sono altamente specializzati e regolano, attraverso la deubiquitinazione, substrati specifici, indicando che un sottile equilibrio tra ubiquitazione e deubiquitinazione è fondamentale per la funzione proteica. Gli E3 e i DUB, insieme ai meccanismi proteasomeri di degradazione e ai fattori accessori, formano il sistema Ubiquitin Proteasome System (UPS, con geni >1200) che regola i principali percorsi di segnalazione, molti dei quali sono associati alla crescita cellulare e alla proliferazione, determinazione del destino cellulare, differenziazione, migrazione cellulare, e la morte delle cellule. È importante sottolineare che la deregolazione di diverse cascate di segnalazione che coinvolgono l’ubiquitazione promuove la tumoralgenesi e le malattie di neurodegenerazione5,11,12,13, 14.
L’ubiquitazione svolge ruoli pervasivi nella biologia della cromatina e nei processi dipendenti dal DNA15,16,17. Per esempio, la monoubiquitinazione dell’istono H2A sulla lisina 119 (qui dopo H2A K119ub) è una modifica fondamentale post-traduzionale coinvolta nella repressione trascrizionale e nella riparazione del DNA18,19,20, 21,22. H2A K119ub è catalizzato dal Polycomb Repressive Complex 1 (PRC1), che svolge un ruolo chiave nel mantenimento delle informazioni epigenetiche ed è altamente conservato dalla Drosophila all’uomo. Canonical PRC1 è costituito in particolare dal RING1B e BMI1, che sono il complesso principale E3 ubiquitin ligase responsabile del suddetto evento di ubiquitinazione22,23. In Drosophila, la monoubiquitinazione H2A (H2A K118ub che corrisponde a H2A K119ub nei mammiferi) è invertita dal DUB Calypso, che interagisce con Additional Sex Comb (ASX) formando il complesso DUB policomb-repressivo (PR-DUB)24. L’ortologo mammifero di calypso, BAP1, è un soppressore tumorale cancellato o inattivato in varie neoplasie umane25,26,27,28, 29 del 22 221 , 30 milio , 31 Milia , 32 Milia risse , 33.BAP1 regola i processi dipendenti dal DNA nel nucleo e l’apoptosi mediata dalla segnalazione del calcio al reticolo endoplasmico33,34,35,36, 37 Mi lasa’ di , 38 Mi lasa , 39 mila: l’altro , 40 anni ( , 41 del sistema , 42. BAP1 assembla complessi proteici multi-subunità contenenti regolatori di trascrizione in particolare ASXL1, ASXL2 e ASXL3 (ASXL), tre ortologhi di ASX38,43. Gli ASXL utilizzano il dominio DEUBiquitinase ADaptor (DEUBAD), anche chiamato dominio ASXM, per stimolare l’attività BAP1 DUB35,36,44. Quindi, gli ASXL svolgono un ruolo importante nel coordinare l’attività di BAP1 DUB alla cromatina e più in generale la sua funzione di soppressore tumorale.
Esistono diversi metodi per studiare i processi di ubiquitinazione e deubiquitinazione. In particolare, i saggi biochimici che utilizzano proteine purificate dai batteri rimangono molto potenti nel dimostrare l’ubiquitinazione diretta o la rimozione dell’ubiquitina da substrati specifici. Questi esperimenti possono essere condotti per studiare una serie di parametri come la determinazione del requisito di complessi minimi, la determinazione della cinetica delle reazioni, la definizione delle relazioni struttura/funzione e la comprensione dell’impatto mutazioni genetiche. Qui, forniamo protocolli per condurre reazioni di ubiquitinazione e deubiquitinazione su substrati di cromatina con componenti purificati. Come sistema modello, viene presentata l’ubiquitinazione in vitro e la deubiquitinazione della proteina H2A nucleosomica. Le proteine purificate dai batteri assemblate in complessi minimi di RING1B/BMI1 e BAP1/DEUBAD vengono utilizzate rispettivamente per l’ubiquitinazione o la deubiquitinazione del nucleosomal H2A.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ci sono diversi vantaggi di stabilire robusti saggi di ubiquitinazione in vitro e deubiquitinazione per le proteine di interesse. Questi saggi possono essere utilizzati per: (i) stabilire condizioni ottimali e definire requisiti minimi per queste reazioni, (ii) determinare costanti cinetiche e biochimiche enzimatiche, (iii) definire i ruoli dei cofattori o inibitori che possono influenzare queste reazioni, (iv) identificare le interfacce di interazione, (v) testare l’impatto di mutazioni artificiali o associate alla mala…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo Diana Adjaoud per l’assistenza tecnica. Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni del Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (2015-2020), Genome Quebec (2016-2019) e Genome Canada (2016-2019) a E.B.A. E.B.A. è uno studioso senior del Fonds de la Recherchetchedu duébec-Santé (FRQ-S). L.M e N.S.K. hanno una borsa di dottorato dal FRQ-S. H.B ha ricevuto una borsa di studio presso il Ministero dell’istruzione superiore e dalla ricerca scientifica della Tunisia e dalla Fondazione Cole.
Materials
| Amylose agarose beads | New England Biolabs | #E8021 | |
| Amicon Ultra 0.5 ml centrifugal filters 10K | Sigma-Aldrich | #UFC501096 | |
| Anti-H2AK119ub (H2Aub) | Cell Signaling Technology | #8240 | |
| Anti-Flag-agarose beads | Sigma-Aldrich | #A4596 | |
| Anti-protease cocktail | Sigma-Aldrich | #P8340 | |
| BL21 (DE3) CodonPlus-RIL bacteria | Agilent technologies | #230240 | |
| DMEM | Wisent | #319-005-CL | |
| Empty chromatography column | Biorad | #731-1550 | |
| Flag peptide | Sigma-Aldrich | #F3290 | |
| GSH-agarose beads | Sigma-Aldrich | #G4510 | |
| HEK293T | ATCC | #CRL-3216 | |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | #I5513 | |
| Micrococcal nuclease (MNase) | Sigma-Aldrich | #N3755 | |
| Ni-NTA agarose beads | ThermoFisher Scientific | #88221 | |
| N-methylmaleimide (NEM) | Bioshop | #ETM222 | |
| Pore syringe filter 0.45 μm | Sarstedt | #83.1826 | |
| Polyethylenimine (PEI) | Polysciences Inc | #23966-1 | |
| pGEX6p2rbs-GST-RING1B(1-159)-Bmi1(1-109) | Addgene | #63139 | |
| Ub Activating Enzyme (UBE1) | Boston Biochem | #E-305 | |
| UBCH5C (UBE2D3) | Boston Biochem | #E2-627 |
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