Nitropeptide प्रोफ़ेशनल और पहचान एंजियोटेन्सिन द्वितीय द्वारा सचित्र
Summary
टायरोसिन-नाइट्रेटेड प्रोटीन की प्रोटीओमिक प्रोफाइलिंग 3-नाइटोटिरोसिन संशोधन की कम बहुतायत के कारण एक चुनौतीपूर्ण तकनीक रही है। यहाँ हम मॉडल के रूप में Angiotensin द्वितीय का उपयोग करके nitropeptide संवर्धन और रूपरेखा के लिए एक उपन्यास दृष्टिकोण का वर्णन. इस विधि इन विट्रो में अन्य के लिए या विवो सिस्टम में बढ़ाया जा सकता है.
Abstract
प्रोटीन नाइट्रेशन टायरोसिन अवशेषों पर सबसे महत्वपूर्ण पोस्ट-ट्रांसलेशनल संशोधनों (पीटीएम) में से एक है और इसे यूकैरियोटिक कोशिकाओं में प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (आरओएस) और प्रतिक्रियाशील नाइट्रोजन प्रजातियों (आरएनएस) के रासायनिक कार्यों से प्रेरित किया जा सकता है। प्रोटीन पर नाइट्रेशन साइटों की सटीक पहचान प्रोटीन नाइट्रैन से संबंधित शारीरिक और रोग जनक प्रक्रियाओं को समझने के लिए महत्वपूर्ण है, जैसे सूजन, उम्र बढ़ने, और कैंसर। चूंकि नाइट्रेट प्रोटीन प्रेरित परिस्थितियों में भी कोशिकाओं में कम बहुतायत के होते हैं, इसलिए प्रोटीन नाइट्रनेशन साइटों की रूपरेखा और पहचान के लिए कोई सार्वभौमिक और कुशल तरीके विकसित नहीं किए गए हैं। यहाँ हम एक रासायनिक कमी प्रतिक्रिया और बायोटिन लेबलिंग का उपयोग करके nitropeptide संवर्धन के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन, उच्च संकल्प मास स्पेक्ट्रोमेट्री के बाद. हमारी विधि में, nitropeptide डेरिवेटिव उच्च सटीकता के साथ पहचाना जा सकता है. हमारी विधि पहले रिपोर्ट की गई विधियों की तुलना में दो लाभ दर्शाती है। सबसे पहले, डाइमेथिल लेबलिंग का उपयोग निट्रोप्टिड पर प्राथमिक अमीन को ब्लॉक करने के लिए किया जाता है, जिसका उपयोग मात्रात्मक परिणाम उत्पन्न करने के लिए किया जा सकता है। दूसरा, एनएचएस-बायोटिन अभिकर्मक युक्त एक डिसुलाइड बांड का उपयोग संवर्धन के लिए किया जाता है, जिसे और कम किया जा सकता है और एक बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमीटर पर पता लगाने के संकेत को बढ़ाने के लिए ऐल्किलेट किया जा सकता है। इस प्रोटोकॉल को सफलतापूर्वक वर्तमान कागज में मॉडल पेप्टाइड एंजियोटेन्सिन द्वितीय के लिए लागू किया गया है.
Introduction
प्रोटीन में टायरोसिन अवशेषों का नाइट्राशन 3-नाइटोटिरोसिन बनाने के लिए कई जैविक प्रक्रियाओं को नियंत्रित करता है। टायरोसिन और 3-नाइटोटिरोसिन के बीच विभिन्न रासायनिक गुणों के कारण, नाइट्रेटेड प्रोटीन में एक नाइट्रेट्ड संकेतन गतिविधि1,2हो सकती है। इसलिए, यह तरीकों कि समृद्ध और प्रोटीन पर नाइट्करण साइटों कुशलता से पहचान कर सकते हैं विकसित करने के लिए महत्वपूर्ण है. के रूप में 3-nitrotyrosine पीटीएम के अन्य रूपों की तुलना में प्रोटीन पर एक कम बहुतायत संशोधन है, इस तरह के फॉस्फोरिलेशन और एसिटाइलेशन के रूप में, यह सेल लाइनों या ऊतक के नमूने से सीधे अंतर्जात नाइट्रेशन साइटों की पहचान करने के लिए चुनौतीपूर्ण है. फिर भी, बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री (एमएस) का उपयोग करने के लिए नाइट्रोपेप्टाइड केविखंडन पैटर्न की विशेषता का उपयोग करने की पद्धति विकसित किया गया है (उदाहरण के लिए, झान और Desiderio 3), जो नाइट्रोप्रोटोमिक्स के नए तरीकों के लिए नींव देता है.
वर्तमान में, एमएस द्वारा पीछा एक संवर्धन कदम nitroptide रूपरेखा4,5के लिए सबसे शक्तिशाली रणनीति है. संवर्धन विधियों को दो वर्गों में वर्गीकृत किया जा सकता है। एक वर्ग एंटीबॉडी पर आधारित है जो विशेष रूप से 3-नीट्रोटोइरोसिन को पहचान सकता है, जबकि दूसरा वर्ग रासायनिक व्युत्पत्ति पर आधारित होता है जो नाइट्रो समूह को एक खान समूह4,5में कम कर देता है। एंटीबॉडी आधारित विधि के लिए, nitrotyrosine आत्मीयता स्तंभ संवर्धन के लिए प्रयोग किया जाता है, जिसमें से eluted सामग्री आगे हल किया जाता है और उच्च संकल्प एमएस6,7द्वारा विश्लेषण किया. रासायनिक व्युत्पत्ति-आधारित विधि के लिए, पेप्टाइड या lysine के एन-टर्मिनस पर amine समूहों या तो एसिटाइलेशन द्वारा पहले कदम में अवरुद्ध किया जाना चाहिए, सापेक्ष और निरपेक्ष परिमाणीकरण के लिए आइसोबारिक टैग (iTRAQ), या अग्रानुम जन टैग (TMT) अभिकर्मकों. इसके बाद, एक reducer का उपयोग न्यूफॉर्म किए गए अमीन समूह को संशोधित करने के बाद नीट्रोटिरोसिन को कम करने के लिए किया जाता है, जिसमें बायोटिन लिगेशन, सल्फाइड्रिल पेप्टाइड रूपांतरण, या अन्य प्रकार की टैगिंग सिस्टम8,9, 10,11. अब तक स्थापित अधिकांश प्रोटोकॉल अंतर्जात रूप से नाइट्रेट प्रोटीन के बजाय विट्रो ओवर-नाइट्रेटेड प्रोटीन पर आधारित हैं।
वर्तमान अध्ययन में, निट्रोटिरोसिन के रासायनिक व्युत्पत्ति की एक संशोधित प्रक्रिया निट्रोपेप्टाइड संवर्धन और पहचान के लिए विकसित की गई है, जो एमएस का पता लगाने के दौरान बढ़ी हुई संवेदनशीलता को दर्शाता है और परिमाणीकरण उद्देश्य के लिए उपयुक्त है। हमारे हाल के अध्ययन जैविक प्रणालियों में इस विधि को रोजगार की पहचान की है कि lymphocyte-विशिष्ट प्रोटीन tyrosine kinase के नाइट्राशन (LCK) Tyr394 में माइलॉयड व्युत्पन्न दमन कोशिकाओं से उत्पादित आरएनएस द्वारा (MDSCs) में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है ट्यूमर माइक्रोएनवायरनमेंट12का इम्यूनोसुप्रेशन | इसलिए, nitropetide पहचान की हमारी विधि जटिल जैविक नमूनों के लिए लागू किया जा सकता है के रूप में अच्छी तरह से. यहाँ, हम मॉडल पेप्टाइड एंजियोटेन्सिन द्वितीय का उपयोग करके हमारे प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं, जिनमें से विखंडन पैटर्न जाना जाता है और एक उदाहरण के रूप में नाइट्रोप्रोटोमिक अध्ययन8,9,10,11में व्यापक रूप से उपयोग किया जाता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
यहाँ प्रोटोकॉल nitropeptide संवर्धन और रूपरेखा का वर्णन करता है. एंजियोटेन्सिन II को मॉडल पेप्टाइड के रूप में उपयोग करके, हमने चित्र 1में दर्शाई गई प्रक्रिया को सचित्र बनाया है। नाइट्रो-एंजियोटेन्स?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह काम अमेरिकन कैंसर सोसायटी संस्थागत अनुसंधान अनुदान IRG-14-195-01 द्वारा समर्थित किया गया था (एम शेरोन स्टैक प्रधान अन्वेषक है; X.L. एक उप-प्राप्तकर्ता अन्वेषक है). इस प्रकाशन अनुदान संख्या KL2 TR002530 और UL1 TR002529 (ए शेखर, पीआई) से राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान, राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान, उन्नत अनुवाद विज्ञान, नैदानिक और अनुवाद विज्ञान पुरस्कार से आंशिक समर्थन के साथ संभव बनाया गया था. एक्स एल इंडियाना CTSI KL2 युवा अन्वेषक पुरस्कार के एक प्राप्तकर्ता है. एस एफ वाल्टर कैंसर फाउंडेशन द्वारा समर्थित है बुनियादी कैंसर अनुदान Advanceing. X. डब्ल्यू चीन जनरल प्रोग्राम के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन द्वारा समर्थित है (अनुदान नहीं 817773047).
Materials
| Acclaim pepmap 100 C18 column | Thermo-Fisher | 164534 | |
| 1 M TEAB solution | Sigma-Aldrich | T7408 | |
| 50% hydroxylamine | Thermo-Fisher | 90115 | |
| Acetonitrile | Thermo-Fisher | A955 | MS Grade |
| dithiothreitol | Sigma-Aldrich | 43819 | |
| formaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | Molecular Biology Grade |
| formaldehyde-D2 | Toronto Research Chemicals | F691353 | |
| formic acid | Sigma-Aldrich | 695076 | ACS reagent |
| Fusion Lumos mass spectrometer | Thermo | ||
| isoacetamide | Sigma-Aldrich | I1149 | |
| Methanol | Thermo-Fisher | A456 | MS Grade |
| NHS-S-S-bition | Thermo-Fisher | 21441 | |
| Oasis HLB column (10 mg) | Waters | 186000383 | |
| peroxynitrite | Merck-Millipore | 516620 | |
| sodium cyanoborohydrite | Sigma-Aldrich | 42077 | PhamaGrade |
| sodium dithionate | Sigma-Aldrich | 157953 | Technical Grade |
| Streptavidin Sepharose | GE Healcare | GE17-5113-01 | |
| Ultimate 3000 nanoLC | Thermo |
References
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