血管紧张蛋白II图解的硝酸分析与鉴定
Summary
由于三硝基酪氨酸修饰的丰度较低,酪氨酸硝酸蛋白的蛋白组谱分析一直是一项具有挑战性的技术。在这里,我们描述了一种利用血管紧张蛋白II作为模型来增强和分析硝基肽扩脂的新方法。此方法可以扩展到其他体外或体内系统。
Abstract
蛋白质硝化是酪氨酸残留物最重要的转化后修饰(PTM)之一,可由真核细胞中活性氧种(ROS)和活性氮(RNS)的化学作用诱导。精确识别蛋白质上的硝化位点对于了解与蛋白质硝化(如炎症、老化和癌症)相关的生理和病理过程至关重要。由于硝酸盐蛋白即使在诱导条件下细胞中的丰度较低,因此没有开发用于分析和识别蛋白质硝化位点的普遍有效方法。在这里,我们描述了使用化学还原反应和生物锡标记,然后是高分辨率质谱法的硝基肽富集方案。在我们的方法中,硝基肽衍生物可以高精度地识别。与之前报告的方法相比,我们的方法具有两个优点。首先,二甲基标记用于阻断硝基肽上的主要胺,可用于生成定量结果。其次,使用含有NHS生物锡试剂的二硫化物键进行浓缩,进一步减少和烷基化,以增强质谱仪上的检测信号。该协议已成功应用于本论文中的肽血管紧张剂II模型。
Introduction
蛋白质中酪氨酸残留物的硝化形成3-硝基酪氨酸调节许多生物过程。由于酪氨酸和3-硝基酪氨酸之间的化学性质不同,硝酸盐蛋白可能具有扰动信号活性1,2。因此,开发能够有效地丰富和识别蛋白质上的硝化位点的方法非常重要。与其他形式的PTM(如磷酸化和乙酰化)相比,3-硝基酪氨酸对蛋白质的丰度修饰是一种低丰度修饰,因此直接从细胞系或组织样本中识别内源性硝化位点是具有挑战性的。然而,使用质谱法(MS)来描述硝基肽的破碎模式的方法已经开发出来(例如,Zhan & Desiderio 3),为硝基蛋白质组学的新方法奠定了基础。
目前,MS之后的扩充步骤是硝基肽分析4,5的最强大策略。浓缩方法可以分为两类。一类基于抗体,可以具体识别3-硝基酪氨酸,而另一类是基于化学衍生,减少硝基组胺组4,5。对于基于抗体的方法,硝基酪氨酸亲基柱用于浓缩,从中,洗脱物质通过高分辨率MS6,7进一步解毒和分析。对于基于化学衍生的方法,肽或赖氨酸的N-终点处的胺组应通过乙酰化、相对和绝对定量(iTRAQ)的异物标记或串联质量标记(TMT)试剂在第一步中阻断。接下来,一个减少剂用于减少亚硝基酪氨酸到氨基酪氨酸,然后修改新形成的胺组,其中包括生物素结扎,磺二醇肽转化,或其他类型的标记系统8,9, 10,11.迄今建立的大多数协议都基于体外过度硝酸盐蛋白,而不是内生硝酸盐蛋白。
本研究针对硝基肽的富集和鉴定,开发了硝基酪氨酸化学衍生的改良程序,表明在MS检测过程中灵敏度增强,适合定量。我们最近在生物系统中采用这种方法的研究表明,由骨髓衍生抑制细胞(MDSc)产生的RNS在Tyr394的Tyr394中,淋巴细胞特异性蛋白酪氨酸激酶(LCK)的硝化在肿瘤微环境的免疫抑制12。因此,我们的硝基肽鉴定方法也可以应用于复杂的生物样品。在这里,我们使用肽血管紧张症II模型来描述我们的协议,其中分裂模式在硝基蛋白酶研究8、9、10、11中为已知和广泛使用。
Protocol
Representative Results
Discussion
此处的协议描述了硝肽富集和分析。使用血管紧张蛋白II作为模型肽,我们说明了如图1所示的过程。获得硝基血管紧张蛋白II后,肽上的主要胺应被阻断,以避免进一步的胺结合,这是协议中最关键的步骤之一。在目前的协议中,二甲基标记用于阻断原胺有两个原因:第一,它允许获得定量结果;第二,它允许获得定量结果;其次,这种反应的成本低于NHS为基础的反应,阻塞效率<sup class="xref"…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作得到了美国癌症协会机构研究赠款IRG-14-195-01的支持(M.SharonStack是首席研究员;X.L. 是子接收者调查员)。该出版物是在国家卫生研究院、国家促进转化科学中心、临床和转化科学奖授予编号 KL2 TR002530 和 UL1 TR002529(A. Shekhar, PI) 的部分支持下制作的。X. L. 是印第安纳州 CTSI KL2 青年调查员奖的获得者。S.F.由沃尔瑟癌症基金会支持,该基金会推进基本癌症基金。X.W.由中国国家自然科学基金总体计划(授权号817773047)支持。
Materials
| Acclaim pepmap 100 C18 column | Thermo-Fisher | 164534 | |
| 1 M TEAB solution | Sigma-Aldrich | T7408 | |
| 50% hydroxylamine | Thermo-Fisher | 90115 | |
| Acetonitrile | Thermo-Fisher | A955 | MS Grade |
| dithiothreitol | Sigma-Aldrich | 43819 | |
| formaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | Molecular Biology Grade |
| formaldehyde-D2 | Toronto Research Chemicals | F691353 | |
| formic acid | Sigma-Aldrich | 695076 | ACS reagent |
| Fusion Lumos mass spectrometer | Thermo | ||
| isoacetamide | Sigma-Aldrich | I1149 | |
| Methanol | Thermo-Fisher | A456 | MS Grade |
| NHS-S-S-bition | Thermo-Fisher | 21441 | |
| Oasis HLB column (10 mg) | Waters | 186000383 | |
| peroxynitrite | Merck-Millipore | 516620 | |
| sodium cyanoborohydrite | Sigma-Aldrich | 42077 | PhamaGrade |
| sodium dithionate | Sigma-Aldrich | 157953 | Technical Grade |
| Streptavidin Sepharose | GE Healcare | GE17-5113-01 | |
| Ultimate 3000 nanoLC | Thermo |
References
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