أوبسونوفاجوسيتيك قتل المقايسة لتقييم الاستجابات المناعية ضد مسببات الأمراض البكتيرية
Summary
هذا الإنزيم قتل أوبسونوفاجوسيتيك يستخدم لمقارنة قدرة الخلايا المناعية متجولة التجاوب وتقتل البكتيريا التي تستند إلى معالجات مختلفة و/أو شروط. كلاسيكي، هذا التحليل بمثابة المعيار الذهبي لتقييم الوظائف المستجيب للأجسام المضادة التي أثيرت ضد بكتيريا طاهية.
Abstract
أحد جوانب رئيسية للاستجابة المناعية للاستعمار الجرثومي للمضيف هو البلعمه. مقايسة قتل أوبسونوفاجوسيتيك (أوبكا) هو إجراء تجريبية التي خلايا متجولة مثقف يشترك مع وحدات البكتيرية. وسوف phagocytose الخلايا المناعية وقتل الثقافات البكتيرية بطريقة تعتمد على تكملة. كفاءة قتل الخلايا المناعية بوساطة يعتمد على عدد من العوامل، ويمكن استخدامها لتحديد البكتيريا المختلفة كيفية مقارنة الثقافات فيما يتعلق بالمقاومة لموت الخلايا. وبهذه الطريقة، يمكن تقييم فعالية العلاجات المحتملة المستندة إلى المناعة ضد السلالات البكتيرية محددة و/أو اللقاح. في هذا البروتوكول، يصف لنا أوبكا مبسطة التي تستخدم شروط الثقافة الأساسية وخلية العد لتحديد صلاحية الخلايا البكتيرية بعد ثقافة المشارك مع ظروف العلاج و HL-60 الخلايا المناعية. وقد استخدمت هذه الطريقة بنجاح مع عدد من اللقاح المكوّرات الرئوية مختلفة، الحافظة وسلالات أكابسولار، وغيرها من الأنواع البكتيرية. مزايا هذا البروتوكول أوبكا هي بساطته، براعة (كما لا يقتصر هذا الفحص على العلاجات جسم أوبسونينس)، والتقليل إلى أدنى حد من الوقت والمواد الكاشفة لتقييم المجموعات التجريبية الأساسية.
Introduction
أوبسونوفاجوسيتيك مما أسفر عن مصرع الإنزيم (أوبكا) أداة حاسمة لربط التعديلات في هيكل البكتيرية أو دالة للتغيرات اللاحقة في الاستجابة المناعية والدالة. على هذا النحو، فإنه كثيرا ما يستخدم كتحليل تكميلي لتحديد فعالية العلاجات جسم، المرشحين اللقاح، إنزيم الأمثل، إلخ المستندة إلى جهاز المناعة. حين المجراة في فحوصات ضرورية لتحديد فعالية التخليص أو الحماية في نموذج عدوى بكتيرية، أوبكا يمكن أن تستخدم لتقييم مساهمة محصنة إلى موت الخلايا البكتيرية المكونات الأساسية في معظم: البكتيريا والخلايا المناعية، والتجريبية العلاجات. وقد أظهرت الدراسات السابقة أن أوبكاس يمكن تعديلها واستخدامها لمجموعة متنوعة من البكتيريا واللقاح، بما في ذلك العقدية الرئوية1،2من المكوّرات العنقودية الذهبية، الزائفة الزّنجاريّة3. وعلاوة على ذلك، يمكن استخدام هذه الاختبارات الأمثل لتقييم علاجات تجريبية مختلفة، بما في ذلك قدرة إنزيم جعل البكتيريا أكثر يسرا لتكملة بوساطة الخلايا المناعية4 وجسم علاجات لتحسين أوبسونيزاتيون5. كلاسيكي، الإنزيم أوبكا وقد استخدمت بنجاح في مجال البحوث الأساسية والسريرية الناجمة عن الإعدادات كمؤشر قوي لحماية الأجسام المضادة الخاصة بالعوامل الممرضة6،،من78،9 .
يمكن استخدام أنواع مختلفة من الخلايا المناعية للتقييم لقتل أوبسونوفاجوسيتيك. أحد السكان متجولة استخداماً هو خط الخلية ليوكيميك البشرية HL-60. يمكن الاحتفاظ بهذا الخط خلية بروميلوسيتيس المعطل في الثقافة؛ ومع ذلك، يمكن أن تكون متباينة في مختلف الدول المنشط عن طريق المخدرات مختلف العلاجات10،11. علاج HL60 مع N، N-ديميثيلفورماميدي يميز خط الخلية في العَدلات مفعّلة مع النشاط متجولة قوية11. حين يكون قد تم تحسين HL-60 الخلايا وتستخدم بشكل متكرر لهذه الاختبارات البلعمه10، يمكن استخدام أخرى الكريات البيض النوى الأولية كذراع محصنة من التجربة12.
بالإضافة إلى ذلك، هذه فحوصات يمكن أن تكون مبسطة13 أو14 إلقاء نظرة على السلالات المقاومة للمضادات الحيوية متعددة من البكتيريا لاختبار متعدد. الأسلوب متعدد أحرز أكثر جدوى من خلال تطوير البرمجيات التي يمكن عد كفاءة مستعمرة بكتيرية تشكيل وحدات (كفوس) كل بقعة على لوحة أجار15. وهنا يصف لنا طريقة مبسطة باستخدام سلالة بكتيرية واحدة HL-60 الخلايا، وتكملة الأرنب الرضيع ولوحات أجار الدم. باستخدام هذا الأسلوب، يمكن تقييم علاجات متعددة بسرعة لمعالجة مسائل بحثية محددة حول كيف يمكن أن يكون التضمين الاستجابة المناعية الفطرية للعدوى البكتيرية.
Protocol
Representative Results
Discussion
أوبكاس تخدم أدوار أساسية في تقييم الاستجابات المناعية الأجسام المضادة بوساطة الناجمة عن التطعيم6،8. المغزى الرئيسي لهذه أوبكا مبسطة هو قدرة على التكيف في الظروف لفحصها (أي الأجسام المضادة، والعلاجات إنزيم، إلخ.). وبهذا المعني، بينما يمكن استخدام هذا التحلي…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونحن نشكر الدكتور القمر Nahm (جامعة ألاباما في برمنغهام) له مساعدة لا تقدر بثمن في إنشاء أوبكا فحوصات في المختبر. وأيد هذا العمل “المعاهد الوطنية للصحة منحة” 1R01AI123383-01A1 إلى فيا.
Materials
| Annexin V (APC conjugated) | BioLegend | 640919 | |
| anti-CD35, human (PE conjugated) | BioLegend | 333405 | |
| anti-CD71, human (PE conjugated) | BioLegend | 334105 | |
| bacterial strain to be used (ie, Streptococcus pneumoniae, WU2) | Bacterial Respiratory Reference Laboratory (Dr. Moon Nahm) | ||
| blood agar plates | Hardy Diagnostic | A10 | |
| Fetal Clone serum | HyClone | SH30080.03 | |
| glycerol | Sigma | G9012-1L | |
| HL-60 cells | ATCC | CCL-240 | |
| IgG Isotype Control (PE conjugated) | BioLegend | 400907 | |
| N,N-dimethylformamide (DMF) | Fisher Chemical | UN2265 | |
| propidium iodide | Sigma | P4864 | |
| RPMI media with L-glutamine | Corning | 10-040-CV |
References
- Romero-Steiner, S., et al. Standardization of an opsonophagocytic assay for the measurement of functional antibody activity against Streptococcus pneumoniae using differentiated HL-60 cells. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 4 (4), 415-422 (1997).
- Nanra, J. S., et al. Capsular polysaccharides are an important immune evasion mechanism for Staphylococcus aureus. Human Vaccines and Immunotherapeutics. 9 (3), 480-487 (2013).
- Ishibashi, K., Yamaguchi, O., Shiraiwa, Y., Ogihara, M., Shigeta, S. Combination therapy of Pseudomonas aeruginosa pyelonephritis in neutropenic mice with human antilipopolysaccharide monoclonal antibody and cefsulodin. Journal of Urology. 155 (6), 2094-2097 (1996).
- Middleton, D. R., Paschall, A. V., Duke, J. A., Avci, F. Y. Enzymatic Hydrolysis of Pneumococcal Capsular Polysaccharide Renders the Bacterium Vulnerable to Host Defense. Infection and Immunity. , (2018).
- Baker, C. J., Noya, F. J. Potential use of intravenous immune globulin for group B streptococcal infection. Reviews of Infectious Diseases. 12, 476-482 (1990).
- Tian, H., Weber, S., Thorkildson, P., Kozel, T. R., Pirofski, L. A. Efficacy of opsonic and nonopsonic serotype 3 pneumococcal capsular polysaccharide-specific monoclonal antibodies against intranasal challenge with Streptococcus pneumoniae in mice. Infection and Immunity. 77 (4), 1502-1513 (2009).
- Parameswarappa, S. G., et al. A Semi-synthetic Oligosaccharide Conjugate Vaccine Candidate Confers Protection against Streptococcus pneumoniae Serotype 3 Infection. Cell Chemical Biology. 23 (11), 1407-1416 (2016).
- Jackson, L., et al. Randomized clinical trial of a single versus a double dose of 13-valent pneumococcal conjugate vaccine in adults 55 through 74 years of age previously vaccinated with 23-valent pneumococcal polysaccharide vaccine. Vaccine. 36 (5), 606-614 (2018).
- Cywes-Bentley, C., et al. Antibody to a conserved antigenic target is protective against diverse prokaryotic and eukaryotic pathogens. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 110 (24), 2209-2218 (2013).
- Fleck, R. A., Romero-Steiner, S., Nahm, M. H. Use of HL-60 cell line to measure opsonic capacity of pneumococcal antibodies. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 12 (1), 19-27 (2005).
- Collins, S. J., Ruscetti, F. W., Gallagher, R. E., Gallo, R. C. Terminal differentiation of human promyelocytic leukemia cells induced by dimethyl sulfoxide and other polar compounds. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 75 (5), 2458-2462 (1978).
- Melnick, N., Rajam, G., Carlone, G. M., Sampson, J. S., Ades, E. W. Evaluation of a novel therapeutic approach to treating severe pneumococcal infection using a mouse model. Clinical and Vaccine Immunology. 16 (6), 806-810 (2009).
- Dwyer, M., Gadjeva, M. Opsonophagocytic assay. Methods in Molecular Biology. 1100, 373-379 (2014).
- Burton, R. L., Nahm, M. H. Development of a fourfold multiplexed opsonophagocytosis assay for pneumococcal antibodies against additional serotypes and discovery of serological subtypes in Streptococcus pneumoniae serotype 20. Clinical and Vaccine Immunololgy. 19 (6), 835-841 (2012).
- Clarke, M. L., et al. Low-cost, high-throughput, automated counting of bacterial colonies. Cytometry Part A. 77 (8), 790-797 (2010).
- Aanei, C. M., et al. Database-guided Flow-cytometry for Evaluation of Bone Marrow Myeloid Cell Maturation. Journal of Visualized Experiments. (141), e57867 (2018).
- Hirz, T., Dumontet, C. Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents. Journal of Visulaized Experiments. (109), e53846 (2016).
- Rieger, A. M., Nelson, K. L., Konowalchuk, J. D., Barreda, D. R. Modified annexin V/propidium iodide apoptosis assay for accurate assessment of cell death. Journal of Visualized Experiments. (50), 2597 (2011).
- Blair, O. C., Carbone, R., Sartorelli, A. C. Differentiation of HL-60 promyelocytic leukemia cells: simultaneous determination of phagocytic activity and cell cycle distribution by flow cytometry. Cytometry. 7 (2), 171-177 (1986).
- Middleton, D. R., et al. Identification and characterization of the Streptococcus pneumoniae type 3 capsule-specific glycoside hydrolase of Paenibacillus species 32352. Glycobiology. 28 (2), 90-99 (2018).
