Lägre dödande Assay att bedöma immunologiska reaktion mot bakteriella patogener
Summary
Denna lägre dödande analys används för att jämföra förmågan hos fagocytos immunceller för att svara på och döda bakterier baserat på olika behandlingar och/eller villkor. Klassiskt, serverar denna analys som den gyllene standarden för att bedöma effektor funktioner av antikroppar mot en bakterie som opsonin.
Abstract
En viktig aspekt av immunsvaret mot bakteriell kolonisering av värden är fagocytos. Ett lägre dödande test (OPKA) är en experimentell förfarande där Fagocytos celler är samtidig odlade med bakteriell enheter. Immuncellerna kommer phagocytose och döda bakteriekulturerna i en Komplementberoende sätt. Effektiviteten i immunmedierade cell dödandet är beroende av ett antal faktorer och kan användas för att avgöra hur olika bakteriella kulturer jämföra när det gäller motstånd mot celldöd. På detta sätt kan effekten av potentiella immun-baserade therapeutics bedömas mot specifika bakteriestammar och/eller serotyper. I detta protokoll beskriver vi en förenklad OPKA som använder grundläggande odlingsbetingelser och cell inventering för att bestämma bakteriell cellernas viabilitet efter samtidig kultur med behandling villkor och HL-60 immunceller. Denna metod har använts framgångsrikt med ett antal olika pneumokock serotyper, kapsulära och acapsular stammar och andra bakteriearter. Fördelarna med detta OPKA protokoll är dess enkelhet, mångsidighet (som denna analys inte är begränsat till antikropp behandlingar som opsonins), och minimering av tid och reagenser till bedöma grundläggande experimentella grupper.
Introduction
Den lägre döda assay (OPKA) är ett kritiskt verktyg för att länka förändringar i bakteriell struktur eller funktion till efterföljande förändringar i immunförsvaret och funktion. Som sådan, används det ofta som en kompletterande analys för att bestämma immun-baserade effekten av antikropp behandlingar, vaccinkandidater, enzym optimering, etc. Medan Invivo analyser är nödvändigt att fastställa effektiva clearance eller skydd i en bakteriell infektion modell, OPKA kan användas för att bedöma immun bidrag till bakteriell celldöd på den mest grundläggande komponenter: bakterier, immunceller, och experimentella behandlingar. Tidigare studier har visat att OPKAs kan ändras och används för en mängd bakterier och serotyper, inklusive Streptococcus pneumoniae1, Staphylococcus aureus2, Pseudomonas aeruginosa3. Dessutom kan dessa optimerade analyser användas för att bedöma olika experimentella behandlingar, inklusive möjligheten av ett enzym att göra bakterien mer tillgänglig för komplement-medierad immunceller4 och antikropp behandlingar för att förbättra Opsonization5. Klassiskt, OPKA assay har använts framgångsrikt i basal och klinisk forskning inställningar som en kraftfull indikator för skydd induceras av patogen-specifika antikroppar6,7,8,9 .
Olika typer av immunceller kan användas för bedömning av lägre dödande. En vanligt förekommande fagocytos befolkning är HL-60 mänsklig leukemic cell linjen. Denna cellinje kan hållas som inaktiverade promyelocyter i kultur; de kan dock skiljas in olika aktiverade staterna via olika läkemedel behandlingar10,11. Behandling av HL60 med N, N-dimetylformamid gör åtskillnad mellan den cellen fodrar in aktiverade neutrofiler med stark fagocytisk aktivitet11. HL-60 celler har optimerats och används ofta för dessa fagocytos analyser10, kan andra primära polymorfonukleära leukocyter användas som experiment12immun arm.
Dessutom dessa analyser kan vara förenklade13 eller multiplexed14 att titta på flera antibiotikaresistenta stammar av bakterier som ska testas. Metoden multiplexade har gjorts mer genomförbart genom utveckling av programvara som effektivt kan räkna bakteriell kolonibildande enheter (CFUs) per plats på en agar tallrik15. Här beskriver vi en strömlinjeformad metod där en bakteriestam, HL-60 celler, baby kanin komplement och blod agarplattor. Med den här metoden kan flera behandlingar bedömas snabbt för att lösa specifika forskningsfrågor på hur medfödda immunsvaret mot bakterieinfektion kan anpassas.
Protocol
Representative Results
Discussion
OPKAs tjäna viktiga roller vid bedömningen av antikropp medierad immunsvar induceras av vaccinationer6,8. Den huvudsakliga betydelsen av denna förenklade OPKA är anpassningsförmåga i de villkor som ska testas (dvs, antikroppar, enzym behandlingar, etc.). I denna mening, medan denna analys kan användas för att testa bidrag opsonins (dvs antikroppar) i fagocytos, kan det också användas för att bedöma olika sätt att övervinna virulensfaktorer (dvs kaps…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar Dr. Moon Nahm (University of Alabama Birmingham) för hans ovärderliga stöd i upprättandet av OPKA analyser i vårt laboratorium. Detta arbete stöds av nationella institut för hälsa Grant 1R01AI123383-01A1 att FYA.
Materials
| Annexin V (APC conjugated) | BioLegend | 640919 | |
| anti-CD35, human (PE conjugated) | BioLegend | 333405 | |
| anti-CD71, human (PE conjugated) | BioLegend | 334105 | |
| bacterial strain to be used (ie, Streptococcus pneumoniae, WU2) | Bacterial Respiratory Reference Laboratory (Dr. Moon Nahm) | ||
| blood agar plates | Hardy Diagnostic | A10 | |
| Fetal Clone serum | HyClone | SH30080.03 | |
| glycerol | Sigma | G9012-1L | |
| HL-60 cells | ATCC | CCL-240 | |
| IgG Isotype Control (PE conjugated) | BioLegend | 400907 | |
| N,N-dimethylformamide (DMF) | Fisher Chemical | UN2265 | |
| propidium iodide | Sigma | P4864 | |
| RPMI media with L-glutamine | Corning | 10-040-CV |
References
- Romero-Steiner, S., et al. Standardization of an opsonophagocytic assay for the measurement of functional antibody activity against Streptococcus pneumoniae using differentiated HL-60 cells. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 4 (4), 415-422 (1997).
- Nanra, J. S., et al. Capsular polysaccharides are an important immune evasion mechanism for Staphylococcus aureus. Human Vaccines and Immunotherapeutics. 9 (3), 480-487 (2013).
- Ishibashi, K., Yamaguchi, O., Shiraiwa, Y., Ogihara, M., Shigeta, S. Combination therapy of Pseudomonas aeruginosa pyelonephritis in neutropenic mice with human antilipopolysaccharide monoclonal antibody and cefsulodin. Journal of Urology. 155 (6), 2094-2097 (1996).
- Middleton, D. R., Paschall, A. V., Duke, J. A., Avci, F. Y. Enzymatic Hydrolysis of Pneumococcal Capsular Polysaccharide Renders the Bacterium Vulnerable to Host Defense. Infection and Immunity. , (2018).
- Baker, C. J., Noya, F. J. Potential use of intravenous immune globulin for group B streptococcal infection. Reviews of Infectious Diseases. 12, 476-482 (1990).
- Tian, H., Weber, S., Thorkildson, P., Kozel, T. R., Pirofski, L. A. Efficacy of opsonic and nonopsonic serotype 3 pneumococcal capsular polysaccharide-specific monoclonal antibodies against intranasal challenge with Streptococcus pneumoniae in mice. Infection and Immunity. 77 (4), 1502-1513 (2009).
- Parameswarappa, S. G., et al. A Semi-synthetic Oligosaccharide Conjugate Vaccine Candidate Confers Protection against Streptococcus pneumoniae Serotype 3 Infection. Cell Chemical Biology. 23 (11), 1407-1416 (2016).
- Jackson, L., et al. Randomized clinical trial of a single versus a double dose of 13-valent pneumococcal conjugate vaccine in adults 55 through 74 years of age previously vaccinated with 23-valent pneumococcal polysaccharide vaccine. Vaccine. 36 (5), 606-614 (2018).
- Cywes-Bentley, C., et al. Antibody to a conserved antigenic target is protective against diverse prokaryotic and eukaryotic pathogens. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 110 (24), 2209-2218 (2013).
- Fleck, R. A., Romero-Steiner, S., Nahm, M. H. Use of HL-60 cell line to measure opsonic capacity of pneumococcal antibodies. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 12 (1), 19-27 (2005).
- Collins, S. J., Ruscetti, F. W., Gallagher, R. E., Gallo, R. C. Terminal differentiation of human promyelocytic leukemia cells induced by dimethyl sulfoxide and other polar compounds. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 75 (5), 2458-2462 (1978).
- Melnick, N., Rajam, G., Carlone, G. M., Sampson, J. S., Ades, E. W. Evaluation of a novel therapeutic approach to treating severe pneumococcal infection using a mouse model. Clinical and Vaccine Immunology. 16 (6), 806-810 (2009).
- Dwyer, M., Gadjeva, M. Opsonophagocytic assay. Methods in Molecular Biology. 1100, 373-379 (2014).
- Burton, R. L., Nahm, M. H. Development of a fourfold multiplexed opsonophagocytosis assay for pneumococcal antibodies against additional serotypes and discovery of serological subtypes in Streptococcus pneumoniae serotype 20. Clinical and Vaccine Immunololgy. 19 (6), 835-841 (2012).
- Clarke, M. L., et al. Low-cost, high-throughput, automated counting of bacterial colonies. Cytometry Part A. 77 (8), 790-797 (2010).
- Aanei, C. M., et al. Database-guided Flow-cytometry for Evaluation of Bone Marrow Myeloid Cell Maturation. Journal of Visualized Experiments. (141), e57867 (2018).
- Hirz, T., Dumontet, C. Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents. Journal of Visulaized Experiments. (109), e53846 (2016).
- Rieger, A. M., Nelson, K. L., Konowalchuk, J. D., Barreda, D. R. Modified annexin V/propidium iodide apoptosis assay for accurate assessment of cell death. Journal of Visualized Experiments. (50), 2597 (2011).
- Blair, O. C., Carbone, R., Sartorelli, A. C. Differentiation of HL-60 promyelocytic leukemia cells: simultaneous determination of phagocytic activity and cell cycle distribution by flow cytometry. Cytometry. 7 (2), 171-177 (1986).
- Middleton, D. R., et al. Identification and characterization of the Streptococcus pneumoniae type 3 capsule-specific glycoside hydrolase of Paenibacillus species 32352. Glycobiology. 28 (2), 90-99 (2018).
