Summary

L'hybridation in situ chromogénique est un outil pour le diagnostic du cancer de la tête et du cou lié au VPH

Published: June 14, 2019
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Summary

L’hybridation in situ de l’ARN de papillomavirus humain (HPV) est considérée comme l’une des normes d’or pour la détection active d’infection par le papillomavirus humain dans les tumeurs. Il permet la visualisation de l’expression de l’ARNm HPV E6-E7 avec la localisation et l’évaluation semi-quantitative de son signal.

Abstract

L’infection par le virus du papillome humain (VPH) est un facteur de risque majeur pour un sous-type de carcinome épistologique oropharyngé (OPSCC), qui tend à être associé à de meilleurs résultats que l’OPSCC lié à l’alcool et au tabac. L’hybridation in situ chromogénique (CISH) de l’ARN viral du VPH pourrait permettre l’évaluation semi-quantitative des transcriptions virales des protéines oncogènes E6 et E7 et une visualisation in situ avec une bonne résolution spatiale. Cette technique permet de diagnostiquer une infection active avec la visualisation de la transcription du VPH dans les cellules infectées par le VPH tumoral. Un avantage de cette technique est l’évitement de la contamination des cellules non-néoplastiques HPV-infectées adjacentes à la tumeur. Dans l’ensemble, ses bons résultats en matière de diagnostic ont été considérés comme l’étalon-or pour l’identification active de l’infection par le VPH. Étant donné que l’interaction des protéines virales E6 et E7 avec les protéines cellulaires pRb et p53 est obligatoire pour la transformation cellulaire, l’ARN HPV CISH est fonctionnellement pertinent et reflète vivement l’infection oncogène active par le VPH. Cette technique est également pertinente sur le plan clinique puisque des niveaux de transcription du VPH « faibles » ou « élevés » ont aidé à identifier deux groupes de pronostic chez les patients atteints d’un cancer de la tête et du cou positif au VPH. Ici, nous présentons le protocole pour l’ARN HPV manuel CISH effectué sur formaline-fixe paraffine-embedded (FFPE) diapositives avec un kit obtenu auprès du fabricant. Au lieu de la révélation chromogénique, l’hybridation in situ d’ARN peut également être exécutée avec la révélation fluorescente (RNA FISH). Il peut également être combiné avec l’immunostaining conventionnel.

Introduction

L’ARN VPH CISH est un outil puissant pour la détection de l’infection active par le VPH, qui peut s’avérer cruciale dans les lésions bénignes ou malignes à divers endroits tels que l’oropharynx ou le col utérin. La détection d’une infection active au VPH peut appuyer le diagnostic d’une lésion induite par le VPH et, par conséquent, influencer son traitement et son pronostic.

Le VPH est l’infection sexuellement transmissible la plus fréquente, et plus de 100 génotypes viraux ont été décrits1. Schématiquement, on sait que les génotypes à faible risque comme les génotypes 6 et 11 induisent des verrues génitales, une papillomatose respiratoire récurrente et d’autres lésions bénignes, tandis que les génotypes à haut risque tels que les génotypes 16 et 18 sont responsables de la plupart des cancers du col de l’utérus. et les cancers anaux et jouent un rôle dans l’oncogenèse HNSCC dans des proportions variables comme expliqué par les données épidémiologiques régionales2.

Plusieurs outils sont disponibles pour la détection de l’infection par le VPH. Comme une infection à haut risque du VPH conduit à l’expression des protéines oncogènes virales E6 et E73, la détection des transcriptions E6 et E7 est largement considérée comme l’étalon-or pour l’identification active de l’infection par le VPH4. L’ARN VPH CISH peut être effectué sur des échantillons de FFPE qui sont assez facilement obtenus auprès de patients souffrant de diverses maladies liées au VPH. Sa performance a été évaluée dans la néoplasie intraépithéliale squamous dans le col de l’utérus, l’anus, et le vagin, et dans le carcinome épidermoïde invasif dans le col de l’utérus, l’anus, et le tractus aérodigestif supérieur5: il atteint une sensibilité de plus de 98% parmi les cas positifs de réaction en chaîne de polymérase d’ADN de HPV (PCR) C’est légèrement mieux que p16 immunostaining (93%) et l’hybridation in situ de l’ADN du VPH (DNA ISH : 97 %), qui sont plus couramment utilisées. Dans une autre cohorte de 57 patients présentant le carcinome épidermoïde (CSC) résultant de la région de tête et de cou, de la région génitale, de la peau, et de l’appareil urinaire, comparé à l’ISH d’ADN de HPV, l’ARN de HPV CISH a réalisé une meilleure sensibilité (100% contre 88%) et la spécificité (87% contre 74%)6.

L’immunostaining P16 est un marqueur indirect reflétant la perturbation du cycle cellulaire qui peut être causée (mais pas exclusivement) par l’infection par le VPH4,7. Ce test rentable possède une bonne sensibilité et une valeur prédictive négative et est recommandé comme marqueur de substitution de l’infection à haut risque par le cancer du VPH dans le cancer de l’oropharynx (OPC) par le College of American Pathologists (CAP) et par l’Union for International Lutte contre le cancer (UICC)8.

Bien que cet article se concentre uniquement sur la détection du VPH dans HNSCC, HPV ARN CISH est cliniquement pertinent dans diverses autres conditions qui impliquent l’infection par le VPH. Par exemple, cette technique peut améliorer l’exactitude du diagnostic des lésions intraépithéliales squamous de qualité inférieure du col de l’utérus (LSIL, autrefois connu sous le nom de néoplasie intraépithélial cervicale, catégorie 1 [CIN1]) pour les cas morphologiquement ambigus9. En ce qui concerne le CSC oropharyngé, le CISH de l’ARN Du VPH permet l’identification du CSC lié au VPH, étiqueté comme distinct du CSC oropharyngé sans lien avec le VPH, lors de la huitième édition récente de la Classification TNM du cancer de la tête et du cou (de l’Union for International Cancer Contrôle [UICC])10. Étant donné que le SCC lié au VPH présente un meilleur pronostic avec une survie plus longue et une sensibilité accrue à la radiothérapie et à la chimiothérapie que le CSC11,12,13, la détection de l’infection par le VPH peut avoir un impact gestion du patient14,15. En outre, hPV ARN CISH peut être utilisé pour le diagnostic du carcinome multiphénotypic multiphénotypic avec un signal plus élevé que l’ADN hPV CISH16. Plusieurs analyses multivariées suggèrent que la détection des transcriptions E6 et E7 est corrélée avec un meilleur pronostic dans le SCC oropharyngé global7,15,17,18 et dans le sous-groupe de p16-positive oropharyngeal SCC19,20.

Ici, nous présentons le protocole pour l’ARN HPV manuel CISH effectué sur les diapositives FFPE avec un kit obtenu auprès du fabricant.

Protocol

Le protocole suit des directives éthiques et a été approuvé par le Comité d’éthique (Comité-de-Protection-des-Personnes Ile-de-France-II, #2015 09-04). 1. Préparation des matériaux Préparation d’un tampon de lavage 1x Préparer 3 L de 1x tampon de lavage en ajoutant 2,94 L d’eau distillée et une bouteille (60 ml) de tampon de lavage (50x) (voir la table des matériaux) à un grand carboy. Bien mélanger.REMARQUE : Le tampon …

Representative Results

Comme décrit ici, dans le cancer de cellules squamous de tête et de cou, un cas peut être considéré positif en présence de la coloration punctiforme brune dans le cytoplasme ou dans les noyaux des cellules de tumeur. Dans la plupart des études, le signal est considéré comme « positif » ou « non détecté »14. Des méthodes de semi-quantification du signal ont été signalées mais manquent de normalisation entre les équipes. Par exemple, dans certaines études, les signaux ont été …

Discussion

L’ARN VPH CISH effectué avec un kit acheté est un outil puissant pour la détection des transcriptions virales et il indique une infection active au VPH. Exécutées manuellement, les étapes du protocole sont globalement faciles à suivre, et le kit acheté est pratique. Cette technique permet la coloration de 19 échantillons histologiques plus une diapositive de contrôle à la fois, et l’analyse dure environ 8 h. Il est essentiel de ne pas laisser les échantillons sécher entre les étapes, sauf indication contrai…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Les auteurs remercient le département de pathologie de l’Hopital Européen Georges Pompidou et Necker (Laurianne Chambolle, Elodie Michel et Gisèle Legall); la plate-forme d’histologie du PARCC, Hopital Européen Georges Pompidou (Corinne Lesaffre); Virginia Clark pour l’édition linguistique; Alexandra Elbakyan pour sa contribution.

Materials

Hematoxylin solution, Gill No. 1 Merck GHS132
HybEZ Oven (110v) Advanced Cell Diagnostics Inc. 321710
HybEZ slide rack Advanced Cell Diagnostics Inc. 300104
ImmEdge Hydrophobic Barrier Pen Advanced Cell Diagnostics Inc. 310018
RNAscope 2.5 HD Detection Reagents-BROWN Advanced Cell Diagnostics Inc. 322310 This kit includes amplification reagents AMP1, AMP2, AMP3, AMP4, AMP5 and AMP6, and detection reagents DAB-A and DAB-B
RNAscope 3-Plex Negative Control Probe Advanced Cell Diagnostics Inc. 320871 DAPB
RNAscope 3-Plex Positive Control Probe Advanced Cell Diagnostics Inc. 320861 PPIB
RNAscope H202 & Protease Plus Reagent Advanced Cell Diagnostics Inc. 322330 Hydrogen Peroxyde x2 and Protease Plus x 1
RNAscope Probe- HPV16/18 Advanced Cell Diagnostics Inc. 311121
RNAscope Target Retrieval Reagents Advanced Cell Diagnostics Inc. 322000
RNAscope Wash Buffer Reagents Advanced Cell Diagnostics Inc. 310091 Wash Buffer 50X x4

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Cite This Article
Outh-Gauer, S., Augustin, J., Mandavit, M., Grard, O., Denize, T., Nervo, M., Lépine, C., Rassy, M., Tartour, E., Badoual, C. Chromogenic In Situ Hybridization as a Tool for HPV-Related Head and Neck Cancer Diagnosis. J. Vis. Exp. (148), e59422, doi:10.3791/59422 (2019).

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