Пан-лиссавирус вложенной обратной транскрипции полимеразной цепной реакции была разработана для обнаружения конкретно все известные лисовивирусы. Проверка с использованием образцов мозга бешенства различных видов животных показали, что этот метод имеет чувствительность и специфичность эквивалентно золотой стандарт флуоресцентного теста на антитела и может быть использован для рутинной диагностики бешенства.
Для обнаружения вируса бешенства и других видов членов рода Лиссавируса в пределах семейства рхабдовиридае, Пан-лиссавирус вложенного обратной транскрипции полимеразной цепной реакции (ВЛОЖЕННЫЙ RT-СР) был разработан для обнаружения сохранялся регион нуклеопротеин (N) гена лисовивирусов. Метод применяет обратную транскрипцию (RT) с использованием вирусной РНК в качестве шаблона и олиго (dT)15 и случайных гексамеров в качестве праймеров для синтеза вирусной комплементарной ДНК (кДНК). Затем, вирусный cDNA используется в качестве шаблона для усиления 845 BP N фрагмент гена в первом раунде ЦР с использованием внешних праймеров, после второго раунда вложенного КЦР, чтобы усилить окончательный фрагмент 371 BP с использованием внутренней праймеров. Этот метод может обнаруживать различные генетические клады вирусов бешенства (RABV). Проверка, используя 9 624 образцов головного мозга от восьми видов домашних животных за 10 лет клинических диагнозов бешенства и эпиднадзора в Китае, показала, что метод имеет чувствительность 100% и специфичность 99,97% по сравнению с прямым флуоресцентным анализ на антитела (FAT), метод золотого стандарта, рекомендованный Всемирной организацией здравоохранения (ВОЗ) и Всемирной организацией по охране здоровья животных (МЭБ). Кроме того, метод мог бы также специально усилить целевой N фрагмент гена 15 других утвержденных и двух новых видов лизсавирусов в 10-м докладе Международного комитета по таксономии вирусов (ICTV), как оценивается имитирующих обнаружение синтезированных N генных плазмид всех лизовивирусов. Метод обеспечивает удобную альтернативу FAT для диагностики бешенства и был одобрен как Национальный стандарт (GB/T36789-2018) Китая.
Бешенство-это Всемирная зоонозная болезнь, вызываная вирусами в роду Lyssavirus1. Лисавирусы (Family рхабдовиридае)-ОДНОЦЕПОЧЕЧНЫЕ РНК-вирусы с приблизительно 12 КБ генома, который кодирует пять белков: N, Фосфоровирус (P), матричный белок (M), гликопротеин (G), и большой белок или полимеразы (L). На основе нуклеотидных последовательностей гена N, генетического расстояния и антигенных паттернов, лиссавирусами были разделены на 16 видов, включая классический вирус бешенства (rabv) и вирусы, связанные с бешенством (RRV): Лагос-летучая мышь (LBV), вирус duvenhage (дувв ), Вирус мокола (МОКВ), Европейская летучая мышь (EBLV-1), Европейская летучая мышь-лиссавирус 2 Австралийский летучая мышь (АБК), вирус Аравана (АРАВ), вирус Икама (иков), Бокело Бат-лиссавирус (BBLV), Ганнорува Бат лиссавирус (ГБЛВ), вирус Иркут (ИРКВ), Худжанский вирус (ХУВ), вирус Западно-кавказской летучей мыши (WCBV), вирус Симони bat (SHIBV) и Ллеида Бат-лиссарус (ллеб)2. Недавно были выявлены два дополнительных лисовируса: Kotalahti летучая мышь (KBLV), изолированная от летучей мыши Брандт (Myotis brandtii) в финляндии в 20173 и Тайваньская летучая мышь ЛИССАВИРУС (twblv), изолированный от японского пистрелле ( Пьпипиреллус абрамы) на Тайване, Китай в 2016 – 20174.
Все млекопитающие подвержены бешенству; Однако, никакие грубые патогномонические поражения или специфические клинические знаки не разрешают свою идентификацию, и диагноз можно только сделать в лаборатории5. Наиболее широко используемым методом диагностики бешенства является жир, который считается золотым стандартом как для ВОЗ, так и для МЭБ5,6. Тем не менее, жир может производить ненадежные результаты на деградированных/аутолzed образцов мозговой ткани. Кроме того, он не может быть использован для анализа биологических образцов жидкости, таких как спинномозговой жидкости (ЛИКВОРА), слюны и мочи, тем самым в значительной степени исключая его занятости в антеморной диагностики7. Альтернативные обычных диагностических тестов, таких, как бешенство ткани культуры инфекции тест (РЦКМЭ) и тест инокуляции мыши (MIT), требуют несколько дней6, основным недостатком, когда быстрый диагноз имеет важное значение.
Различные молекулярные диагностические тесты (например, обнаружение вирусной РНК с помощью RT-ЦР, терапия с иммуноферментной инфекцией (ЦР-ИФА), гибридизация на месте и в режиме реального времени (СР), используются в качестве быстрых и чувствительных методов диагностики бешенства8. В настоящее время “RT-ЦР” рекомендуется МЭБ для рутинного диагностирования бешенства, а в руководстве по диагностическим испытаниям и вакцинам для наземных животных МЭБ описано описание всех лисивирусов5. Здесь мы описываем “Пан-лиссавирус”, вложенный в-ЦР, что позволяет специфическое и чувствительное обнаружение всех 18 видов лиссавирусов, сопоставимых или превышающих полученные жиром. Принцип метода является RT целевой РНК (сохраняется область лизисавируса N гена) в кДНК, а затем усиление кДНК двумя раундами ЦР. CDNA подвергается в первом раунде КЦР с внешними праймеров, чтобы усилить фрагмент 845 BP; Затем, второй раунд ЦР использует в первом раунде продукта ЦР в качестве шаблона для усиления 371 BP фрагмент с внутренним праймеров. Два раунда ЦР значительно увеличивают чувствительность анализа.
В настоящее время, RABV является одним из основных лизсавирусов, ответственных за почти всех людей и животных, бешенства в Китае, а также в других странах. Кроме того, вариант ИРКВ был впервые идентифицирован с м.урина лойкогстер бат в провинции Цзилинь в северо-восточном Китае в …
The authors have nothing to disclose.
Исследование было поддержано национальным ключевым научно-исследовательским планом развития (Грант No. 2016ИД0500401) и национальным фондом естественных наук Китая (Грант No 31302043).
50 × TAE | Various | Various | |
6 × loading buffer | TakaRa | 9156 | |
Agarose | US Everbright® Inc | A-2015-100g | |
ddH2O | Various | Various | |
DL 2,000 Marker | Takara | 3427A | |
dNTPs (10 mM) | TakaRa | 4019 | |
dNTPs (2.5 mM) | TakaRa | 4030 | |
Electrophoresis System | Tanon | EPS300 | |
Ex-Taq (5 U/μL) | TakaRa | RR001 | |
Gel Imaging System | UVITEC | Fire Reader | |
Microcentifuge tubes | Various | Various | |
M-MLV reverse transcriptase (200 IU/µL) | TakaRa | 2641A | |
NanoDrop 1000 Spectrophotometer | Thermoscientific | ND1000 | |
Oligo (dT)15 | TakaRa | 3805 | |
PCR Machine | BIO-RAD | T100 | |
PCR Tubes | Various | Various | |
Phusion High-Fidelity DNA Polymearase | NEW ENGLAND BioLabs | M0530S | |
Pipettors | Various | Various | |
Random Primer | TakaRa | 3801 | |
RNase Inhibitor (40 IU/µL) | TakaRa | 2313A | |
RNase-free ddH2O | TakaRa | 9102 | |
Taq Buffer (10×) | TakaRa | 9152A | |
Tips | Various | Various | |
Vortex mixer | Various | Various |