Summary
Denne artikkelen beskriver deuteriumoksidfortynningsteknikken hos to pattedyr, et insektiboer og kjøtteter, for å bestemme totalt kroppsvann, mager kroppsmasse, kroppsfettmasse og vannforbruk.
Abstract
Kroppstilstand skåre systemer og kroppen tilstand indekser er vanlige teknikker som brukes for å vurdere helsestatus eller egnethet av en art. Kroppstilstandspoengsystemer er evaluatoravhengige og har potensial til å være svært subjektive. Kroppstilstandindekser kan forvirres ved foraging, effekten av kroppsvekt, samt statistiske og inferential problemer. Et alternativ til kroppstilstand scoring systemer og kroppstilstand indekser bruker en stabil isotop som deuterium oksid for å bestemme kroppssammensetning. Deuteriumoksidfortynningsmetoden er en repeterbar, kvantitativ teknikk som brukes til å estimere kroppssammensetning hos mennesker, dyreliv og innenlandske arter. I tillegg kan deuteriumoksidfortynningsteknikken brukes til å bestemme vannforbruket til et enkelt dyr. Her beskriver vi tilpasningen av deuteriumoksidfortynningsteknikken for å vurdere kroppssammensetning i store brune (Eptesicus fuscus) og for å vurdere vannforbruket hos katter (Felis catis).
Introduction
Kroppstilstand skåre systemer og kroppen tilstand indekser er vanlige teknikker som brukes for å vurdere helsestatus eller fitness av en art1,2. Mange innenlandske og zoologiske arter har unike kroppstilstand scoring (BCS) systemer som brukes til å vurdere et dyrs muskel og overfladisk fettvev3. BCS-vurderingen er imidlertid avhengig av evaluatoren – noe som betyr at BCS er en objektiv eller semikvantitativ måling når den vurderes av en opplært evaluator. I dyrearter brukes kroppstilstandsindekser ofte i stedet for BCS og er basert på et forhold mellom kroppsmasse og kroppsmasse til underarm2. Kroppstilstand indikiditt er ofte forvirret av effekten av foraging og kan forvirres av kroppsstørrelse samt statistiske og inferential problemer4.
Et alternativ til kroppstilstand scoring systemer og kroppstilstand indekser bruker en stabil isotop for å bestemme kroppssammensetning. En vanlig brukt stabil isotop er deuteriumoksid (D2O), en ikke-radioaktiv form for vann der hydrogenatomer er deuterium isotoper. Deuteriumoksidfortynningsmetoden beskrevet i denne studien kan være en ikke-subjektiv, kvantitativ og repeterbar teknikk som brukes til å estimere kroppssammensetning hos mennesker5 og et bredt spekter av arter4,6,7. Denne teknikken kan være en fordel for å studere kroppssammensetningen i dyrelivet. For eksempel kan den brukes til å vurdere langsgående endringer i kroppssammensetning, for eksempel før og etter en ledelseshandling. Men i noen dyreliv arter deuterium oksid kan overvurdere selve vanninnholdet8. Derfor, når du tilpasser teknikken for en art, er det viktig å validere metoden ved å sammenligne deuteriumoksidmetoden med kadaveranalyse for ikke-truede arter. For truede og truede arter bør en ikke-destruktiv metode som dobbel røntgenabsorptiometry (DXA) betraktes som en alternativ sammenligningsmetode til gullstandarddestruktiv metode for fullstendig kadaveranalyse.
I tillegg til kroppssammensetning kan D2O-fortynningsteknikken brukes til å bestemme vannforbruket til et individuelt dyr9. Denne unike anvendelsen av D2O kan brukes til å svare på ikke bare forskningsspørsmål, men kan være nyttig for å vurdere vannforbruket til individuelle dyr(e) plassert i store sosiale miljøer.
Her beskriver vi tilpasningen av D2O-fortynningsteknikken for å vurdere kroppssammensetning i et insekt, store brune (Eptesicus fuscus), og for å vurdere vannforbruket i en kjøtteter, katter (Felis catis).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle eksperimenter som er beskrevet her ble godkjent av University of Missouri Animal Care and Use Committee og utført under Missouri Department of Conservation (MDC) Wildlife Scientific Collection tillatelse (Tillatelse #16409 og #17649).
1. Fremstilling av steril, isotonisk, salinert D2O lagerløsning
- Lag en 50 ml lagerløsning på 9,0 g/l salinert D2O.
- Vei opp 450 mg farmasøytisk karakter NaCl og overfør alle NaCl til et 100 ml, sterilisert beger. Registrer det nøyaktige beløpet nacl til 4 desimaler i laboratorienotisboken.
- Bruk en steril gradert sylinder, mål 50 g ≥ 99,8% deuteriumoksid og overføring til det sterile begeret som inneholder NaCl. Registrer den nøyaktige mengden av deuteriumoksid til 4 desimaler i laboratoriets notatbok eller regneark.
- Filtrer 10 ml isosmotisk styrke NaCl (9,0 g/l) gjennom et ikke-pyrogensterilt diskfilter med submikronporer (0,2 μm).
- Fest en 20 G kanyle til det ikke-pyrogene sterile diskfilteret med submikronporer (0,2 μm) utstyrt med en 10 ml sprøytefat. Sett inn i septum av et 100 ml sterilt tomt hetteglass.
- Fest et vakuumrør til en 22 G nål og sett nålen inn i septumet på det 100 ml sterilt tomme hetteglasset.
- Hell 10 ml av lageroppløsningen i sprøytesylinderen. Slå sakte på vakuumet til D2O-lagerløsningen begynner å filtrere sakte inn i det sterile hetteglasset. Fortsett å helle D2O-lageroppløsningen i sprøytesylinderen til alle 50 ml filtreres.
MERK: Lagerløsningen må kanskje fortynnes eller konsentreres avhengig av den nødvendige dosen. Dosen av D2O vil variere basert på arten og følsomheten til den analytiske metoden. For katter ble arbeidsløsningen brukt til å administrere en dose på 0,7 g/kg D2O. Lagerløsningen beskrevet ovenfor minimerer mengden NaCl-løsning som ble introdusert subkutant til dyret, samtidig som den tillater nøyaktig måling av dosen. For små pattedyr som må denne konsentrasjonen fortynnes til en arbeidsløsning som 0,1600 g/ml. Denne konsentrasjonen gjør at dosen på 0,75 g/kg D2O kan måles nøyaktig og administreres i ca. 100 μL eller mindre NaCl-oppløsning.
2. Utarbeidelse av steril, isotonisk, salinert D2O lager arbeidsløsning for
- Veie et 10 ml tomt sterilt hetteglass og registrere vekt til nærmeste 4 desimaler. Tare skala.
- Bruk en 1,0 ml sprøyte til å overføre 0,65 ml av D2O-lageroppløsningen til det terte, 10 ml tomt sterilt hetteglass. Rekordvekt d2O til 4 desimaler. Tare skala.
- Beregn volumet på D2O i det 10 ml tomme hetteglasset. Bruk følgende formel.
hvor W er registrert vekt og D er tettheten på 99,8% D2O (1,107 g /ml). - Bruk det beregnede volumet og den kjente vekten til D2O til å bestemme volumet av isotonisk saltvann som kreves for å gjøre ~0.1600 g/ml arbeidsløsning.
- Sett inn i septum av 10 ml sterilt hetteglass, 22 G nålen (festet til vakuumrøret). Sett inn i septum av 10 ml sterilt hetteglass, 20 G nålen (festet til en 0,22 μm sprøytefilter utstyrt med en 10 ml sprøytesylinder).
- Hell den beregnede massen/volumet av isotonisk NaCl i sprøytesylinderen og slå på vakuumet for å tillate et sakte drypp inn i det sterile 10 ml hetteglasset.
- Registrer vekten av hetteglasset og sørg for at en ~0.1600 g/ml arbeidsløsning opprettes.
3. Bestemmelse av kroppssammensetning av store brune (Eptesicus fucsus) med D2O
MERK: Lagerløsningen av D2O som brukes i protokollen er 0,1598 g/ml. Før du samler blod, må du sørge for at fjerning av opptil 200 μL blod vil være ≤ 10% av det totale blodvolumet av flaggermusog er innenfor Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) etablerte retningslinjer for blodinnsamling. Alle dyr skal fastes eller magen palperes for å sikre tom mage. Et nylig måltid kan endre dyrets vekt, noe som resulterer i forvirrede resultater siden beregninger for å bestemme kroppsfett stole på kroppsmassen av dyret.
- Bedøve en stor brun.
- Bruk 5,0 % isofluran for induksjon. Oppretthold et stabilt bad med anestesi ved hjelp av 0,5%−3,0 % isofluran.
- Bestem riktig anestesidybde ved å teste pedaluttaksrefleksen (klemme flaggermustærne). skal ikke reagere på følelsen, og luftveiene bør holde seg langsomme og stabile. Juster isoflurane etter behov for å opprettholde et stabilt bad med anestesi.
- Rekordisoflurannivå, hjertefrekvens, respirasjonsfrekvens og annen informasjon som kreves av IACUC.
- Vei den store brune og registrer vekten til 4 desimaler.
- Rengjør uropatagium (halemembran) over interfemoral vene med en alkoholpreppute og la det tørke. Påfør et tynt lag av petroleumjell over interfemoral vene.
- Bruk en 29 G nål til å punktere dorsaldelen av interfemoral vene og samle 100 μL blod ved hjelp av plast natriumheparinkapillærrør. Sørg for tilstrekkelig blanding av hele blodet med natriumheparin ved å rulle hvert rør forsiktig etter oppsamling og merke røret.
- Bruk en DXA-maskin kalibrert for små pattedyr, få tre DXA-skanninger av10.
- Bestem massen (i g) av D2O for å injisere ved å multiplisere flaggermusvekten i kg med D2O-dosen på 0,75 g/kg. Bestem volumet av den beregnede D2O-dosen (V) ved å dele vekten av D2O-dosen ved konsentrasjonen av arbeidsløsningen.
- Bruk en insulinsprøyte med en 29 G kanyle festet til å trekke opp volumet av D2O beregnet. Vekt D2O, insulinsprøyteog kanyle. Ta opp til 4 desimaler.
- Injiser D2O subkutant over den dorsal hip regionen av bedøvet.
- La komme seg fra anestesi og registrere tidspunktet for injeksjon.
- Umiddelbart etter injeksjon, veie den nå tomme insulinsprøyten med 29 G nålen festet. Registrere vekten til 4 desimaler.
- Bestem dosen av D2O injisert ved å trekke fra insulinsprøytens postinjeksjonsvekt fra den ferdiginjeksjons-D2O fylte insulinsprøyten. Ta opp til 4 desimaler.
- Innen 30 min post blod samling, bruk en hematokrit sentrifuge å spinne hver kapillær rør for 5 min. Hvis hematokritsentrifuge tillater flere hastigheter, satt til 10.000 x g.
- Bruk en skarp saks til å kutte plastkapillærrøret mellom hele blodet og plasmaet. Bruk en 200 μL pipette til å utvise plasmaet direkte i et merket, 500 μL oppbevaringsrør.
- Etter likevektsperioden samler du ytterligere 100 μL blod fra interfemoral vene.
MERK: Likevektsperioden vil variere etter art og hvis går inn i torpor. For store brune er vanligvis 2 h tilstrekkelig for likevektsperioden. - Skill plasma i et annet merket, 500 μL mikrocentrifuge skrueplaterør ved å gjenta trinn 3.13. Oppbevar prøver ved -20 °C eller kaldere til analysen.
4. Fourier-transform infrarød spektrofototrianalyse
- Still inn temperaturen på et sandbad til 60 °C for å lette destillasjonen (tillat separasjon av vann og D2O fra andre blodkomponenter).
- Pipette 50 μL av hver plasmaprøve og standard på innsiden av en 1,5 ml konisk mikrocentrifugerørhette. Inkludert standarder som inneholder kjente konsentrasjoner av D2O som kvalitetskontroll.
MERK: Ideelt sett vil hvert dyr ha tre replikasper prøve og gjennomsnittet av de tre replikaene som rapporteres. På grunn av det begrensede prøvevolumet og volumet av prøven som kreves for FT-IR-utstyret som brukes av forfatterne, ble det ikke utført noen replikas for flaggermusprøvene. Hvis noen prøve inneholder mindre enn 50 μL plasma, pipette prøvemengden på den koniske mikrocentrifugerørhetten og registrerer volumet. - Hold mikrocentrifugehetten opp ned og skru 1,5 ml konisk mikrocentrifugerør på hetten. Plasser det inverterte (opp-ned) røret med hetten i kontakt med sanden i sandbadet i minst 12 timer (over natten).
- Etter 12 timer, fjern hetten og skift ut med en ny, ren hette. Puls mikrocentrifugerøret for 10 s i en sentrifuge.
- Lag følgende standarder: 0 ppm (0 mg D2O i 1 L destillert vann), 293 ppm (293 mg D2O i 1 L destillert vann), 585 ppm (585 mg D2O i 1 L destillert vann), 878 ppm (878 mg D2O i 1 L destillert vann), og 1170 ppm D2O (1170 mg D2O i 1 L destillert vann).
MERK: Verdiene ovenfor foreslås for en standardkurve. Alternative verdier som 250 ppm, 500 ppm, 750 ppm, og så videre kan brukes. - Installer en flytende overføringscelle i Fourier-transform infrarød spektrofotometri (FTIR) spektrometer (Materialtabell). Fyll cellen med metanol og koble til injeksjonsporten. Fyll cellen langsomt med bakgrunnsvann mens du forsiktig fjerner metanolsprøyten for å redusere risikoen for luftbobler. Fest slangen til utgangsporten for å tillate fjerning av prøvene etter analyse.
- Forbered FTIR spektrometerprogramvare (Materialtabell)for analyse av D2O i vann. Parameterinnstillingene for spektrometerprogramvaren som brukes i denne protokollen, er oppført i tabell 1.
- Samle en bakgrunnsprøve ved hjelp av fortynningsvann, 0,22 μmfiltrert, destillert vann. Dette bør være det samme vannet som brukes for standardene.
- Injiser 40 μL av 0 spm D2O og registrer spektrasen. Lagre spektrasen som en CSV-fil (kommadelte verdier).
- Fortsett å injisere og lagre spektra av alle standarder for å skape en standard kurve.
- Gjenta bakgrunnen og standardkurven hver 60-90 min.
- Injiser 40 μL av hver destillert prøve i væskeoverføringscellen og lagre spektra.
MERK: Endre injeksjonsvolumet av standardene og destillerte prøver basert på volumet av væskeoverføringscelle. Bruk en mindre volum væskeoverføringscelle hvis prøvevolumet er under 40 μL eller fortynner 1:1 med bakgrunnsdestillert vann. - Bestem konsentrasjonen av D2O av hver prøve fra FTIR spectra ved hjelp av et regnearkprogram som beskrevet av Jennings et al.11 eller spektralprogramvaren. Når replikerer utføres, bruk den gjennomsnittlige konsentrasjonen til å beregne kroppssammensetningen.
5. Beregning av kroppssammensetning
- Konverter deuterium berikelse (ppm) til atom prosent konsentrasjon for hver prøve ved hjelp av følgende ligning12:
der x er målt deuterium berikelse (ppm) av prøven og 0,0001557 er mole brøkdelen av deuterium rapportert i Vienna Standard Mean Ocean Water (VSMOW)13. - Beregn totalt kroppsvann for hver prøve ved hjelp av følgende formel4,12,14:
)
hvor E er målt berikelse (atom%) av deuterium i prøven etter bakgrunnskorreksjon, B er injeksjonsmassen i g, og 0,998 er konsentrasjonen av injisert D2O.
MERK: Deuteriumutveksling med labilhydrogen forårsaker en 2% overvurdering av total kroppsvannmasse. Totalt kroppsvann bør korrigeres ved å redusere det totale kroppsvannmasseestimatet med 2% av kroppsvekten. - Anslå fettfri masse (lean body mass og alle andre ikke-fett komponenter) av hver ved hjelp av følgende ligning:
MERK: Bruk den konvensjonelt aksepterte verdien av 0,732 for det fraksjonelle fuktighetsinnholdet i lean body mass for sunne, euhydrerte, ikke-ammende. Det fraksjonelle fuktighetsinnholdet i fettfri masse kan endres i ammende store brune basert på post-partum uke15. For andre arter, bruk verdiene publisert i litteraturen eller bestemme fraksjonelt fuktighetsinnhold av lean body mass før du utfører beregninger av lean body mass. - Anslå kroppsfettmassen ved hjelp av følgende ligning:
- Konverter kroppsfettmassen i g til prosent kroppsfettmasse ved hjelp av følgende ligning:
)
6. Bestemmelse av vannsammensetning i en kjøtteter (Felis catus, huskatt)
- Klargjør lagerløsningen som beskrevet i avsnitt 1.
- Vei hver katt til de nærmeste 3 desimalene og registrer vekt. Beregn dosen for hver katt som beskrevet i trinn 3.6 ved hjelp av en D2O dose på 0,70 g/kg.
- Forbered hver dose som beskrevet i trinn 3.7−3.8. ved bruk av en 3 ml eller 5 ml sprøyte med en 22 G kanyle i stedet for en insulinsprøyte.
- Samle 500 μL fullblod og administrer deretter subkutant 0,7 g/kg D2O. Sentrifugefullblod ved 2000 x g i 15 min og lagre plasma i 1,5 ml mikrocentrifugeskruetopprør ved -20 °C til analyse.
- Samle 500 μL fullblod 4 timer etter injeksjon. Sentrifuge fullblod ved 2000 x g i 15 min og lagre plasma i 1,5 ml mikrocentrifuge skrueplaterør ved -20 °C til analyse.
- Samle 500 μL fullblod 14 dager etter injeksjon. Sentrifuge fullblod ved 2000 x g i 15 min og lagre plasma i 1,5 ml mikrocentrifuge skrueplaterør ved -20 °C til analyse.
MERK: Antall dager mellom blodoppsamling kan baseres på de eksperimentelle behovene og etterinjeksjonsperioden der D2O kan oppdages over bakgrunnsnivåene. Fjorten dager var lengden på diettbehandlingsblokkene fra Hooper et al.9. - Utfør FT-IR-analyse i henhold til avsnitt 4 og beregn kroppssammensetningen i henhold til avsnitt 5 i denne protokollen.
- Beregn vannforbruket i ml/dag ved hjelp av følgende ligninger:
hvor TBW er totalt kroppsvann, innledende D2O og endelig D2O er konsentrasjonene målt i ppm i post-injeksjon D2O prøver.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Deuteriumoksidfortynningsteknikken kan brukes til å vurdere kroppssammensetningen av en rekke arter. For å demonstrere tilpasningsevnen rapporterer vi den første bruken av deuteriumoksidfortynningsteknikken i en nordamerikansk insektivorende flaggermusart, Eptesicus fuscus, den store brune for representative resultater. Et timingplatå ble fullført ved å ta pre- og post-D2O injeksjon blodprøver som bør gjøres med noen arter der likevektsperioden er ukjent. Det ble fastslått at to timer etter injeksjon i ikke-torpid var tilstrekkelig for likevekt. Med likevektstiden kjent, ble det totale kroppsvannet, mager kroppsmasse og kroppsfettmasse for 13 villfanget store brune og 8 fangede store brune bestemt (Tabell 2). Ytterligere 2 villfanget store brune og 5 fangede store brune var fast bestemt på å ha en negativ kroppsfettmasse. En negativ kroppsfettmasse beregnes på grunn av en eller flere av følgende årsaker: ikke å motta hele dosen av deuteriumoksid, blir torpid i likevektsfasen, har unormalt store fettmasser og minimal magermasse, eller som har under 3%-5% kroppsfett som bestemme av DXA (Tabell 3).
Hvit-nese syndrom har forårsaket mange arter å avta, så teknikken ble sammenlignet med kroppsfett målt ved hjelp av DXA. Figur 1 viser prosentandelen av kroppsfett bestemt av D2O fortynningsteknikk og DXA (n = 19). De to teknikkene var godt korrelert med en Pearson's r = 0,897 (Figur 2) og var ikke statistisk forskjellige (enveisanalyse av varians (ANOVA), F-verdi = 0,366, p = 0,549). Kroppsfettet viste sterke sammenhenger mellom kroppsfett og kroppsvekt (figur 3). D2O fortynning teknikken ikke konsekvent over eller undervurdere kroppen fett masse.
Deuteriumoksidmetoden er tidligere validert hos katter16. Tabell 4 viser et eksempel på det totale kroppsvannet, mager kroppsmasse og kroppsfettmasse av en enkelt katt9. Hooper et al.9 var den første til å rapportere bruk av deuteriumoksidfortynning for å måle vannforbruket av sosialt huset dyr med det daglige vannforbruket av kattene under hver diettblokk av eksperimentet, som vist i figur 4.
Figur 1: Deuteriumoksid og DXA linjeplott. Hvert punkt representerer kroppsfettprosenten til en individuell som bestemmes av DXA eller deuteriumoksid. Gjennomsnittet er det lyse grønne punktet med feillinjer som indikerer standardfeilen til gjennomsnittet. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Prosentandel av kroppsfett i store brune flaggermus. Deming regresjon (solid blå linje, Pearson's r = 0,897) sammenligne prosentandelen av kroppsfett bestemt av DXA (x-aksen, referansemetoden) og prosentandelen av kroppsfett bestemmes av deuterium oksid (y-akse, testmetoden) i store brune med 95% konfidensintervaller utpekt av grå skyggelegging. Den grønne strekidentitetslinjen som tegnes, representerer regresjonslinjen når metodene er like. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Prosentandel av kroppsfett i store brune sammenlignet med kroppsvekt. Kroppsvekt en plottet mot kroppsfettprosenten bestemt av D2O eller DXA. Det finnes en sterk korrelasjon mellom kroppsvekt og kroppsfett som bestemmes av DXA (mørk blå linje, Pearson's r = 0,88) og D2O (blå linje, Pearson's r = 0,86). Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.
Figur 4: Vannforbruket av sosialt huset katter. Representative resultater av det daglige vannforbruket av sosialt plasserte katter under et eksperiment som evaluerte effekten av kostholdsbestanddeler på vannforbruk. Dette tallet er endret fra Hooper et al.9. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.
| Parameteren | Innstillingen |
| Antall skanninger | 64 |
| Oppløsning | 2 |
| Dataavstand | 0.946 cm-1 |
| Endelig format | Absorbans |
| Korreksjon | Ingen |
| Bruke faste Y-aksegrenser i samlingsvinduet | Min -0,01, Maks 0,03 |
| Benk rekkevidde | Maks 6,38, Min -5.02, Loc 1024 |
| Total absorberende toppfølsomhet | 50 |
| frynser eller kanalisere følsomhet | 80 |
| Derivattopper sensativity | 51 |
| Følsomhet for baselinefeil | 50 |
| CO2 nivåer følsomhet | 19 |
| H2O nivåer følsomhet | 19 |
| Apodization-modus | Happ-Genzel (andre) |
| Fasekorreksjon | Mertz (andre) |
| Filtre som er angitt basert på | Hastighet |
| lavpassfilter | 11,000 |
| høy pass filter | 20 |
Tabell 1: Innstillinger for spektralprogramvare. Parameterinnstillinger som brukes til spektral opptaksprogramvare.
| Dyr | Arter | Kroppsvekt (kg) |
D2O injisert (g) |
Totalt kroppsvann (g) |
Lean kroppsmasse (g) |
Kroppsfett masse (g) |
Kroppsfett masse (%) |
DXA mager + bmc (g) |
DXA fett (g) |
DXA fett (%) |
| 1 | Eptesicus fuscus | 0.01715 | 0.0740 | 11.80 | 16.15 | 1.00 | 5.80 | 14.65 | 0.75 | 4.80 |
| 2 | Eptesicus fuscus | 0.01950 | 0.0920 | 13.80 | 18.83 | 0.69 | 3.50 | 16.20 | 1.40 | 7.90 |
| 3 | Eptesicus fuscus | 0.01677 | 0.08 | 11.33 | 15.47 | 1.30 | 7.74 | 11.33 | 1.30 | 7.74 |
| 4 | Eptesicus fuscus | 0.02129 | 0.097 | 12.51 | 17.09 | 4.20 | 19.7 | 15.9 | 19.65 | 19.2 |
Tabell 2: Kroppssammensetning av store brune flaggermus. De representative resultatene av totalt kroppsvann, mager kroppsmasse og kroppsfett som bestemmes av deuteriumoksidfortynning i store brune er vist i kolonner 5−8. Representative resultater av lean body mass pluss bein mineralinnhold og kroppsfett som bestemmes av DXA i de samme store brune er vist i kolonner 9-11.
| Dyr | Arter | Kroppsvekt (kg) |
D2O injisert (g) |
Totalt kroppsvann (g) |
Lean kroppsmasse (g) |
Kroppsfett masse (g) |
Kroppsfett masse (%) |
DXA mager + bmc (g) |
DXA fett (g) |
DXA fett (%) |
Kommentar |
| 1 | Eptesicus fuscus | 0.0277 | 0.1299 | 34.18 | 46.69 | -19.02 | -68.74 | 9.90 | 26.55 | 62.80 | Equili-bration tid utilstrekkelig |
| 2 | Eptesicus fuscus | 0.0185 | 0.0810388 | 64.23 | 87.75 | -69.25 | -374.33 | 14.20 | 17.30 | 17.95 | Full dose ikke injisert |
| 3 | Eptesicus fuscus | 0.0164 | 0.0719 | 17.38 | 23.74 | -7.33 | -44.68 | 14.15 | 14.40 | 1.70 | Mindre enn 3% fett |
| 4 | Eptesicus fuscus | 0.0212 | 0.0994 | 54.57 | 74.54 | -53.37 | -252.0 | 16.41 | 19.01 | 13.65 | Bat ble torpid (kjølig å berøre) |
Tabell 3: Kroppssammensetning av store brune flaggermus. Representative resultater fra som ikke fikk hele dosen av deuteriumoksid, ble torpid under likevektsfasen, med unormalt stor fettmasse og minimal magermasse, eller under 3%-5% kroppsfett som bestemmes av DXA. De representative resultatene av totalt kroppsvann, mager kroppsmasse og kroppsfett som bestemmes av utvanning av deuteriumoksid er vist i kolonnene 5−8. Representative resultater av lean body mass pluss bein mineralinnhold og kroppsfett som bestemmes av DXA er vist i kolonner 9−11.
| Blokk | Arter | Kroppsvekt (kg) |
D2O injisert (g) |
Totalt kroppsvann (kg) |
Lean kroppsmasse (kg) |
Kroppsfett masse (kg) |
Kroppsfett masse (%) |
Daglig vannforbruk (ml/dag) |
Kostholdsbehandling |
| 1 | Felis Catus | 4.830 | 3.36 | 2.69 | 3.68 | 1.149 | 23.8 | 96.8 | Kontroll |
| 2 | Felis Catus | 4.764 | 3.45 | 2.66 | 3.63 | 1.136 | 23.8 | 217.5 | Høy fuktighet |
| 3 | Felis Catus | 4.727 | 3.25 | 2.50 | 3.41 | 1.314 | 27.8 | 125.1 | Høy Selen |
Tabell 4: Kroppssammensetning og vannforbruk i en enkelt kattedyr. Representative resultater av deuterium oksid fortynningsteknikk for å vurdere lean body mass, fett masse, og vannforbruk av en katt på tre forskjellige tidspunkter under studien utført av Hooper et al.9.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bruken av deuteriumoksid for å bestemme TBW har blitt brukt siden 1940-tallet17 og brukes hos mennesker og en rekke innenlandske og dyreliv arter4,6,7. Andre ikke-destruktive teknikker er utviklet, inkludert bioelektrisk impedansanalyse (BIA), DXA og kvantitativ magnetisk resonans (QMR). Hver metode har fordeler og ulemper som bør vurderes før du velger en bestemt metodikk for å vurdere kroppssammensetning. Denne protokollen valgt å bruke DXA som en sammenligningsmetode for deuteriumoksid for å vurdere kroppssammensetning, fordi utstyret er tilgjengelig som en kjerneuniversitetsressurs med minimal kostnad, minimal tid er nødvendig per skanning (30 s per flaggermus), og det er ikke følsomt for variabler som kroppstemperatur og hudisolasjon.
Ved tilpasning av deuteriumoksidfortynningsteknikken til en art av interesse, bør en pilotstudie initieres for å bestemme tiden det tar for likevekt18. Dette kan gjøres ved å ta en bakgrunnsprøve, og en blodprøve hvert 15. For små arter som, kan flere blø ser på de forskjellige tidsintervallene i stedet for et enkelt dyr18. Likevektstiden kan endre seg når dyr, som, går inn i torpor, noe som forklarer hvorfor noen av våre dyr hadde et negativt prosent kroppsfett (tabell 3). Hvis en negativ prosent kroppsfett oppnås, og deuteriumdosen hadde tilstrekkelig tid til å fullt ut likevektmed dyrets kroppsvann, er det sannsynlig at dosen ikke ble fullstendig injisert. Fordi deuteriumoksidfortynningsteknikken er svært avhengig av at hele dosen administreres og nøyaktig registrering av mengden deuterium injisert, bør denne teknikken bare fullføres av personer som er dyktige til å utføre injeksjoner. I tillegg kan bedøve eller beslaglegge dyr bidra til å sikre at hele dosen kan administreres.
Ved administrering av deuteriumoksid, er det viktig å bestemme en passende konsentrasjon for å administrere til dyret. Ved hjelp av en 0,7 g/kg dose for kattene, var lagerløsningskonsentrasjonen hensiktsmessig, mens for de store brune krevde en 0,75 g/kg dose lagerløsningen av deuteriumoksid som skal fortynnes. Når du fortynner lagerløsningen, bør en isotonisk løsning som 0,9% NaCl brukes. For å unngå å endre det totale kroppsvannet til små pattedyr, fortynn dosen av deuteriumoksid så minimalt som mulig, akkurat nok til å sikre at dosen kan måles nøyaktig.
Dosene som presenteres her er påviselige ved hjelp av FTIR spektrometri. FTIR spektrometri er billigere og enklere å vedlikeholde, men ikke så følsom som isotop ratio massespektrometri (IRMS)19,20. FTIR spektrometri kan brukes til å måle deuterium berikelse i plasma og spytt, men det anbefales ikke å bruke en FTIR overføringscelle for å analysere deuterium berikelse i urin19. Hvis urin er ønsket prøvetype, bør et attenuated total refleksjon (ATR) vedlegg brukes med FTIR eller IRMS brukes til å vurdere deuterium berikelse for beregning av TBW19.
I tillegg var dosene som ble brukt for kattene tilstrekkelige til å tillate påvisning av deuteriumoksid 14 dager etter injeksjon. Fordi konsentrasjonen av deuteriumoksid 14 dager etter injeksjon var påviselig, kunne vannforbruket til kattene beregnes (figur 4). Denne innovative bruken av deuteriumoksid kan brukes i feltstudier for å måle kroppsvannsomsetning for arter med høy gjenfangst eller for dyr som ligger i grupper i ex situ eller laboratoriestudier. Men før de bruker i feltstudier, må forskerne vurdere om dyret kan fanges og holdes i løpet av likevektsperioden. Denne forlengelsesperioden er en av ulempene ved deuteriumoksidteknikken og kan være problematisk, da mange truede arter tillater å begrense varigheten som et bestemt dyr kan holdes. I tillegg kan dyr ikke nylig ha spist som utvaskingsteknikken er avhengig av måling av kroppsmasse; Derfor kan et nylig måltid forvirre resultatene. En annen vurdering er om et dyr må bedøves eller bedøves for subkutan injeksjon og blodsamlinger, eller om dyret kan holdes tilbake uten sedasjon/anestesi. Det har blitt foreslått at frekvensen av kroppsvannomsetning kan være en betydelig indikator for menneskers helse21. Det økte vannforbruket i katt 5 (figur 4) ble dokumentert før tradisjonelle biokjemiske merker av nyresvikt, og konsentrasjoner av kreatinin og blodureanitrogen (BUN) ble forhøyet, noe som tyder på at kroppsvannsomsetningen også kan være en indikator på helse hos dyr.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Denne forskningen ble støttet av MDC Cooperative Agreement (#416), US Forest Service Cooperative Agreement (16-JV-11242311-118), American Academy of Veterinary Nutrition og Waltham/Royal Canin, USA Grant (stipendnummer: 00049049), NIH opplæringsstipend (stipendnummer: T32OS011126), og University of Missouri Veterinary Research Scholars Program. Forfatterne takker Shannon Ehlers for å ha forhåndsanmeldt dette manuskriptet. Vi takker Dr. Robert Backus for å gi D2O standarder og tillate bruk av laboratoriet hans.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 micron non-pyrogenic disk filter | Argos Technologies | FN32S | nylon, 30mm diameter, 0.22um, sterile |
| 1.5 mL conical microcentrifuge tubes | USA Scientific | 1415-9701 | 1.5 ml self-standing microcentrifuge tube, natural with blue cap |
| 10 mL sterile glass vial for injection | Mountainside Medical Equipment | MS-SEV10 | clear, sterile glass injection unit |
| 10 mL syringe | Becton Dickinson | 305219 | sterile 10 mL syringe individually wrapped |
| 100 mL sterile glass vial for injection | Mountainside Medical Equipment | AL-SV10020 | clear, sterile glass injection unit |
| 20 gauge needle | Exel | 26417 | needles hypodermic 20g x 1" plastic hub (yellow) / regular bevel |
| 22 gauge needle | Exel | 26411 | needles hypodermic 22g x 1" plastic hub (black) / regular bevel |
| deuterium oxide | Sigma-Aldrich | 151882-25G | 99.9 atom % D |
| isofluorane | Vetone | 3060 | fluriso isoflurane, USP |
| OMNIC Spectra Software | ThermoFisher Scientific | 833-036200 | FT-IR standard software |
| petroleum jelly | Vaseline | 305212311006 | Vaseline, 100% pure petroleum jelly, original, skin protectant |
| plastic capillary tubes | Innovative Med Tech | 100050 | sodium heparin anticoagulant, 50 μL capacity, 30 mm length |
| Sealed liquid spectrophotometer SL-3 FTIR CAF2 Cell | International Crystal Laboratory | 0005D-875 | 0.05 mm Pathlength |
| sodium chloride | EMD Millipore | 1.37017 | suitable for biopharmaceutical production |
| Thermo Electron Nicolet 380 FT-IR Spectrometer | ThermoFisher Scientific | 269-169400 | discontinued model, newer models available |
References
- Schiffmann, C., Clauss, M., Hoby, S., Hatt, J. M. Visual body condition scoring in zoo animals – composite, algorithm and overview approaches. Journal of Zoo Aquarium Research. 5 (1), (2017).
- Peig, J., Green, A. J. New perspectives for estimating body condition from mass/length data: the scaled mass index as an alternative method. Oikos. 118 (12), 1883-1891 (2009).
- Bissell, H. Body Condition Scoring Resource Center. , https://nagonline.net/3877/body-condition-scoring/ (2017).
- McWilliams, S. R., Whitman, M. Non-destructive techniques to assess body composition of birds: a review and validation study. Journal of Ornithology. 154 (3), 597-618 (2013).
- Lukaski, H. C., Johnson, P. E. A simple, inexpensive method of determining total body water using a tracer dose of D2O and infrared absorption of biological fluids. American Journal of Clinical Nutrition. 41 (2), 363-370 (1985).
- Chusyd, D. E., et al. Adiposity and Reproductive Cycling Status in Zoo African Elephants. Obesity (Silver Spring). 26 (1), 103-110 (2018).
- Kanchuk, M. L., Backus, R. C., Calvert, C. C., Morris, J. G., Rogers, Q. R. Neutering Induces Changes in Food Intake Body Weight, Plasma Insulin and Leptin Concentrations in Normal and Lipoprotein Lipase–Deficient Male Cats. The Journal of Nutrition. 132 (6), 1730S-1732S (2002).
- Eichhorn, G., Visser, G. H. Technical Comment: Evaluation of the Deuterium Dilution Method to Estimate Body Composition in the Barnacle Goose: Accuracy and Minimum Equilibration Time. Physiological and Biochemical Zoology. 81 (4), 508-518 (2008).
- Hooper, S. E., Backus, R., Amelon, S. Effects of dietary selenium and moisture on the physical activity and thyroid axis of cats. Journal of Animal Physiolgy and Animal Nutrition (Berl). 102 (2), 495-504 (2018).
- Stevenson, K. T., van Tets, I. G. Dual-Energy X-Ray Absorptiometry (DXA) Can Accurately and Nondestructively Measure the Body Composition of Small, Free-Living Rodents. Physiological and Biochemical Zoology. 81 (3), 373-382 (2008).
- Jennings, G., Bluck, L., Wright, A., Elia, M. The use of infrared spectrophotometry for measuring body water spaces. Clinical Chemistry. 45 (7), 1077-1081 (1999).
- Beuth, J. M. Body Composition, movemement phenology and habitat use of common eider along the southern new england coast. Master of Science in Biological and Environmental Sciences (MSBES) thesis. , University of Rhode Island. (2013).
- Coplen, T. B., Hopple, J., Peiser, H., Rieder, S. Compilation of minimum and maximum isotope ratios of selected elements in naturally occurring terrestrial materials and reagents. U.S. Geological Survey Water-Resources Investigations Report 01-4222. , (2002).
- Karasov, W. H., Pinshow, B. Changes in lean mass and in organs of nutrient assimilation in a long-distance passerine migrant at a springtime stopover site. Physiological Zoology. 71 (4), 435-448 (1998).
- Hood, W. R., Oftedal, O. T., Kunz, T. H. Variation in body composition of female big brown bats (Eptesicus fuscus.) during lactation. Journal of Comparative Physiology B. 176 (8), 807-819 (2006).
- Backus, R. C., Havel, P. J., Gingerich, R. L., Rogers, Q. R. Relationship between serum leptin immunoreactivity and body fat mass as estimated by use of a novel gas-phase Fourier transform infrared spectroscopy deuterium dilution method in cats. American Journal of Veterinary Research. 61 (7), 796-801 (2000).
- Moore, F. D. Determination of Total Body Water and Solids with Isotopes. Science. 104 (2694), 157-160 (1946).
- Voigt, C., Cruz-Neto, A. Ecological and Behavioral Methods in the Study of Bats. Parsons, S., Kunz, T. H. , John Hopkins University Press. Ch. 30 621-645 (2009).
- International Atomic Energy Agency. Assessment of Body Composition and Total Energy Expenditure in Humans Using Stable Isotope Techniques. , (2009).
- International Atomic Energy Agency. Introduction to Body Composition Assessment Using the Deuterium Dilution Technique with Analysis of Saliva Samples by Fourier Transform Infrared Spectrometry. , (2011).
- Shimamoto, H., Komiya, S. The Turnover of Body Water as an Indicator of Health. Journal of Physiological Anthropology and Applied Human Science. 19 (5), 207-212 (2000).
