Режиме реального времени в Vitro мониторинга одоранта рецептор активации одоранта в паровой фазе

Summary

Физиологически одорант рецепторы активируются одоранта молекул вдыхается в паровой фазе. Однако большинство в пробирке систем используют жидкой фазы одоранта стимуляции. Здесь мы представляем метод, который позволяет в реальном времени в пробирке мониторинга одоранта рецептор активации после стимуляции одоранта в паровой фазе.

Abstract

Обонятельные восприятие начинается с взаимодействием отдушки с рецепторами одоранта (или) выраженные обонятельной сенсорных нейронов (ОСН). Запах признание следующим комбинаторные схемы кодирования, где один или может быть активирован с помощью ряда отдушки и один одорантов можно активировать сочетание ORs. Через такие комбинаторной кодирования, организмы можно обнаруживать и различать мириады летучих запах молекул. Таким образом запах при данной концентрации можно описать активации шаблон СПР, который специфичен для каждого запаха. В этом смысле, растрескивание механизмы, которые мозг использует для восприятия запахов требует понимания одоранта-или взаимодействия. Вот почему обоняние сообщество привержено «де orphanize» эти рецепторы. Обычные в пробирке систем, используемых для идентификации одоранта- или взаимодействия использовали инкубирования ячейки СМИ с одоранта, который отличается от естественной обнаружения запахи через пара отдушки растворения в слизистую оболочку носа до взаимодействия с СПР. Здесь мы опишем новый метод, который позволяет для реального времени наблюдения или активации через паровой фазы отдушки. Наш метод основан на измерения лагеря выхода люминесценции, используя Glosensor assay. Он ликвидирует нынешние пробелы между подходами в vivo и in vitro и обеспечивает основу для biomimetic летучих химических датчика.

Introduction

Обоняние позволяет наземных животных взаимодействовать с их летучие химические среды привод поведения и эмоции. По существу процесс обнаружения запаха начинается с самого первого взаимодействия молекул одоранта с обонятельной системы, на уровне одоранта рецепторов (СПР)¹. В млекопитающих ORs индивидуально выражаются в обонятельной сенсорных нейронов (OSNs), расположенный в обонятельного эпителия². Они принадлежат к семейству рецепторов (GPCR) G-протеин и более точно родопсин как суб семье (также называемый класса A). СПР пара с стимулирующее G протеина G_ФОО чьи Активация приводит к лагеря производства последовали открытия циклических нуклеотидов воротами каналов и поколения потенциалы действия. Принято что ощутили запах опирается на определенный шаблон активированного СПР^3,4 и поэтому запах признание комбинаторные схемы кодирования, где один или может быть активирован с помощью ряда отдушки и один одорантов можно активировать сочетание ORs. И через такие комбинаторной кодирования, постулируется, что организмы может обнаруживать и различать мириады летучих запах молекул. Один из ключей к пониманию, как воспринимают запахи — чтобы понять, как и ORs активируются данной запах.

В попытке прояснить одоранта- или взаимодействия, в пробирке функциональных анализов играют важную роль. Идентификация агонист пахучих лигандов для сирот ORs (или де orphanization) был очень активное поле за последние двадцать лет, с использованием различных в пробирке, ex vivo и в естественных условиях функциональных анализов^{5,6,7 ,8,9,10,11,12,13,14,,1516, 17}.

В пробирке пробирного системы лучше всего подходит для подробных функциональных характеристик ПРС, включая определение функциональные домены и критических остатков СПР, а также потенциал инженерных приложений. Однако дальнейшее развитие ценных в пробирке систем для СПР был вызов, отчасти из-за трудностей с культивирования OSNs и функциональных выражение ORs в гетерологичных клеток. Первая задача заключалась в создании протоколов, которые разрешены для клеток поверхности выражения функциональной ORs в сопоставлении одоранта-или взаимодействия. Ряд независимых групп использовали различные подходы^{5,6,,78,9,10,11,12, 14,18,19,20}. Одним из первых достижений было сделано, Krautwurst et al. в меткой N-конечная СПР с укороченной последовательность родопсина (Ро тегов) и наблюдается улучшение поверхности выражение в клетки человеческого эмбриона почек (ГЭС)¹³. Изменения, сделанные в тег придает последовательность или все еще путь для улучшения или выражение и функциональность^19,21. Сайто et al. затем определил транспортировки рецептора протеина 1 (RTP1) и RTP2, который содействует или торговле. ²² сокращенный вариант RTP1, называемый RTP1S, также было показано быть даже более эффективным, чем оригинальный белка²³. Разработка клеточной линии (Hana3A), которая стабильно выражает G_ФОО, REEP1, RTP1 и RTP2 ²⁴, в сочетании с использованием Репортеры циклический аденозинмонофосфат (лагерь) позволило идентификации одоранта-или взаимодействия. Механизм, по которому RTP семейство белков способствует клеток поверхности выражение ORs предстоит определить.

Одно предостережение этих установленных методов является, что они полагаются на стимуляции одоранта в жидкой фазе, что означает отдушки предварительно растворяют в средство стимуляции и стимулировать клетки путем замены носителя. Это очень отличается от физиологических условиях где одоранта молекулы достигают обонятельного эпителия в паровой фазе и активировать ORs путем растворения в слизистой оболочки носа. Для больше напоминают воздействия физиологически соответствующие стимулы, Sanz et al.²⁰ предложил assay основанный на стимуляции пара путем нанесения капли раствора одоранта повесить под с внутренней стороны пластиковой пленки, размещены на верхней части клетки скважин. Они записали кальция ответы путем мониторинга интенсивности флуоресценции. Этот метод был первым для использования воздуха фаза одоранта стимуляции, но она не позволяет большой показ или активации.

Здесь мы разработали новый метод, который позволяет в режиме реального времени мониторинг в пробирке или активации через паров этапе одоранта стимуляции Glosensor пробу (рис. 1). Этот assay был использован ранее в контексте жидких одоранта стимуляции^{18,19,25,26,27,28,29, 30 , 31}. Мониторинг палаты Люминометр сначала достижение равновесного уровня с испаряется одоранта до пластины чтения (рис. 1А). Одорант молекулы, затем сольватированного в буфер, купание Hana3A клетки, выражая или интерес, RTP1S и Glosensor белков (рис. 1Б). Если одорант агонистов или, или переключиться на активированные конформации и привязать G_ФОО, активации гуанилатциклазы adenylyl (AC) и в конечном итоге вызывают повышение уровня лагеря. Этот рост лагерь будет связывать и активировать Glosensor белка для создания свечения, катализирующих люциферин. Это свечение затем регистрируется с помощью люминометра и позволяет осуществлять мониторинг или активации. Этот метод является большой интерес в контексте или deorphanization, как он приносит в пробирке систем ближе к естественной восприятие запахов.

Protocol

1. Hana3A клетки культуры Подготовить M10 (минимум основных средних (MEM) плюс 10% v/v плода бычьим сывороточным (ФБС)) и M10PSF (М10 плюс 100 мкг/мл пенициллин стрептомицином и амфотерицин B 1,25 мкг/мл). Культура клетки в 10 мл M10PSF в 100 мм ячейку культуры блюдо в инкубаторе в 37 ° C и 5% двуокиси углеро…

Representative Results

Мы показан ответ три мыши ORs, Olfr746, Olfr124 и Olfr1093 с помощью оксима пара стимуляции (рис. 3). Одновременно, мы использовали элемент пустой вектор (Ро pCI), чтобы заверить, что одоранта индуцированной деятельности протестированных ОРС были конкретные (рисA…

Discussion

Восприятие запаха принципиально зависит от активации ORs. Следовательно для того чтобы треснуть сложные механизмы, использующие мозг воспринимать его летучие химические среды требуется понимание их функциональность. Однако понимание этого процесса сдерживается трудностями в создани…

Materials

0.05 % trypsin-EDTA	Gibco	25300-054	0.05% Trypsin – EDTA (1x), phenol red – store at 4°C
100 mm cell culture dish	BD Falcon	353003	100 mm x 20 mm cell culture dish
15 mL tube	BD Falcon	352099	17 mm x 120 mm conical tubes
96-well plate	Corning	3843	96 well, with LE lid white with clear bottom Poly-D-lysine coated Polystyrene
Amphotericin	Gibco	15290-018	Amphotericin B 250 µg/mL – store at 4°C
centrifuge machine	Jouan	C312	Centrifuge machine with swinging bucket rotor for 15 mL
Class II Type A/B3 fumehood	NUAIRE	NU-407-500	fumehood for cell culturing
FBS	Gibco	16000-044	Fetal Bovine Serum – store at -20°C
GloSensor cAMP Reagent	Promega	E1290	GloSensor cAMP Reagent luminescent protein substrate – store at -20°C
Incubator 37 °C; 5 % CO2	Fisher Scientific	11-676-604	Incubator for cell culturing
Lipofectamine 2000 reagent	Invitrogen	11668-019	Lipofectamine 2000 Reagent 1mg/ml transfection reagent – store at 4°C
Luminometer POLARstar OPTIMA	BMG LABTECH	discontinued	96 well plate reader for luminescence
Mineral oil	Sigma	M8410	Solvent for odorants – store at room temperature
Minimum Essential Medium (MEM)	Corning cellgro	10-010-CV	Minimum Essential Medium Eagle with Earle’s salts & L-glutamine – store at 4°C
Penicillin/Streptomycin	Sigma Aldrich	P4333	Penicillin-Streptomycin solution stabilized with 10,000 U of penicillin and 10 mg streptomycin – store at -20°C
pGlosensor	Promega	E2301	pGloSensor-22F cAMP luminescent protein plasmid – store at 4°C
phase contrast microscope	Leica	090-131.001	phase contrast microscope with x4, x10, x20 objectives
RTP1S	H. Matsunami lab	–	100 ng/µL plasmid – store at 4°C