Microscopie d'imagerie hyperspectrale à balayage d'excitation pour discriminer efficacement les signaux de fluorescence

Summary

L’imagerie spectrale est devenue une solution fiable pour l’identification et la séparation des signaux de fluorescence multiples dans un seul échantillon et peut facilement distinguer les signaux d’intérêt du fond ou de l’autofluorescence. L’imagerie hyperspectrale à balayage d’excitation améliore cette technique en diminuant le temps d’acquisition d’image nécessaire tout en augmentant simultanément le rapport signal-bruit.

Abstract

Plusieurs techniques reposent sur la détection des signaux de fluorescence pour identifier ou étudier des phénomènes ou pour élucider les fonctions. La séparation de ces signaux de fluorescence s’est avérée lourde jusqu’à l’avènement de l’imagerie hyperspectrale, dans laquelle les sources de fluorescence peuvent être séparées les unes des autres ainsi que des signaux de fond et de l’autofluorescence (étant donné la connaissance de leurs signatures). Cependant, l’imagerie hyperspectrale traditionnelle de balayage des émissions souffre de temps d’acquisition lents et de faibles rapports signal-bruit en raison du filtrage nécessaire de l’excitation et de la lumière des émissions. Il a déjà été démontré que l’imagerie hyperspectrale de balayage d’excitation réduit le temps d’acquisition nécessaire tout en augmentant simultanément le rapport signal-bruit des données acquises. À l’aide d’équipements disponibles dans le commerce, ce protocole décrit comment assembler, calibrer et utiliser un système de microscopie d’imagerie hyperspectrale à balayage d’excitation pour séparer les signaux de plusieurs sources de fluorescence dans un seul échantillon. Bien que très applicable à l’imagerie microscopique des cellules et des tissus, cette technique peut également être utile pour tout type d’expérience utilisant la fluorescence dans laquelle il est possible de varier les longueurs d’onde d’excitation, y compris, mais sans s’y limiter: l’imagerie chimique, applications environnementales, soins oculaires, sciences alimentaires, sciences médico-légales, sciences médicales et minéralogie.

Introduction

L’imagerie spectrale peut être réalisée de diverses façons et est mentionnée par plusieurs termes^1,2,3,4. En général, l’imagerie spectrale désigne les données acquises dans au moins deux dimensions spatiales et une dimension spectrale. L’imagerie multispectrale et hyperspectrale se distingue le plus souvent par le nombre de bandes de longueur d’onde ou par le fait que les bandes spectrales sont contigus¹. Pour cette application, les données hyperspectrales sont définies comme des données spectrales acquises avec des bandes de longueur d’onde contigus obtenues par espacement des longueurs d’onde du centre au moins la moitié de la largeur totale à la moitié maximale (FWHM) de chaque filtre de bandepass utilisé pour l’excitation (c.-à-d., 5 nm espacement de longueur d’onde centrale pour les filtres bandpass avec des bandes passantes de 14-20 nm). La nature contigue des bandes de données permet un suréchantillonnage de l’ensemble de données, en veillant à ce que les critères de Nyquist soient satisfaits lors de l’échantillonnage du domaine spectral.

L’imagerie hyperspectrale a été développée par la NASA dans les années 1970 et 1980 en conjonction avec le premier satellite Landsat^5,6. La collecte de données à partir de plusieurs bandes spectrales adjacentes a permis la génération d’un spectre d’éclat de chaque pixel. L’identification et la définition du spectre d’éclat des composants individuels ont permis non seulement de détecter les matériaux de surface par leurs spectres caractéristiques, mais aussi d’éliminer les signaux intermédiaires, tels que les variations du signal conditions atmosphériques. Le concept de détection des matériaux à l’aide de leurs spectres caractéristiques a été appliqué aux systèmes biologiques en 1996, lorsque Schck et coll. ont utilisé des combinaisons de cinq fluorophores différents et de leurs spectres connus pour distinguer les chromosomes étiquetés dans un processus appelé karyotypage spectral⁷. Cette technique a été élaborée en 2000 par Tsurui et coll. pour l’imagerie par fluorescence d’échantillons de tissus, à l’aide de sept colorants fluorescents et d’une décomposition de la valeur singulière pour obtenir la séparation spectrale de chaque pixel en combinaisons linéaires de spectres dans la référence. bibliothèque⁸. Semblable à leurs homologues de télédétection, la contribution de chaque fluorophore connu peut être calculée à partir de l’image hyperspectrale, donnée des informations a priori du spectre de chaque fluorophore.

L’imagerie hyperspectrale a également été utilisée dans les domaines de l’agriculture⁹, astronomie¹⁰, biomédecine¹¹, imagerie chimique¹², applications environnementales¹³, soins oculaires¹⁴, science alimentaire¹⁵, science médico-légale^16,17, science médicale¹⁸, minéralogie¹⁹, et la surveillance²⁰. Une limitation clé des systèmes actuels d’imagerie hyperspectrale au microscope fluorescence est que la technologie d’imagerie hyperspectrale standard isole les signaux de fluorescence dans les bandes étroites par 1) filtrant d’abord la lumière d’excitation pour contrôler l’excitation de l’échantillon, puis 2) le filtrage supplémentaire émis la lumière pour séparer l’émission de fluorescence en bandes étroites qui peuvent plus tard être séparées mathématiquement²¹. Le filtrage de l’éclairage d’excitation et de la fluorescence émise réduit la quantité de signal disponible, ce qui abaisse le rapport signal-bruit et nécessite de longs délais d’acquisition. Le faible signal et les longs délais d’acquisition limitent l’applicabilité de l’imagerie hyperspectrale en tant qu’outil de diagnostic.

Une modalité d’imagerie a été développée qui fait usage de l’imagerie hyperspectrale mais amplifie le signal disponible, réduisant ainsi le temps d’acquisition nécessaire^21,22. Cette nouvelle modalité, appelée imagerie hyperspectrale à balayage d’excitation, acquiert des données d’image spectrale en variant la longueur d’onde de l’excitation et en recueillant un large éventail de lumière émise. Il a déjà été démontré que cette technique donne des ordres de grandeur augmentations du rapport signal-bruit par rapport aux techniques de balayage des émissions^21,22. L’augmentation du rapport signal-bruit est en grande partie due au large passage de bande (600 nm) de lumière d’émission détecté, tandis que la spécificité est fournie en filtrant seulement la lumière d’excitation au lieu de l’émission de fluorescence. Cela permet à toute la lumière émise (pour chaque longueur d’onde d’excitation) d’atteindre le détecteur²¹. En outre, cette technique peut être utilisée pour distinguer l’autofluorescence des étiquettes exogènes. En outre, la capacité de réduire le temps d’acquisition en raison de l’augmentation du signal détectable réduit le risque de photoblanchiment ainsi que permet des balayages spectrals à un taux d’acquisition qui est acceptable pour l’imagerie vidéo spectrale.

L’objectif de ce protocole est de servir de guide d’acquisition de données pour la microscopie d’imagerie hyperspectrale à balayage d’excitation. En outre, des descriptions sont incluses qui aident à comprendre le chemin de lumière et le matériel. On décrit également la mise en œuvre d’un logiciel open-source pour un microscope d’imagerie hyperspectrale à balayage d’excitation. Enfin, des descriptions sont fournies sur la façon de calibrer le système selon une norme traçable NIST, d’ajuster les paramètres logiciels et matériels pour obtenir des résultats précis et de démélanger le signal détecté en contributions de composants individuels.

Protocol

1. Configuration de l’appareil Source de lumière : sélectionnez une source de lumière spectrale à large bande avec une puissance élevée et une forte collimation (une lampe à arc de 300 W Xe a été utilisée pour ces études). Obturateur (facultatif) : ajoutez un obturateur à la trajectoire optique pour réduire le photoblanchiment pour l’imagerie en accéléré. Système de filtre réglable : incorporez un ensemble de réglage mécanique et un filtre réglable à couches minces (TFT…

Representative Results

Plusieurs étapes importantes de ce protocole sont nécessaires pour assurer la collecte de données à la fois exactes et dépourvues d’images et d’artefacts spectraux. Le fait de sauter ces étapes peut donner lieu à des données qui semblent importantes mais qui ne peuvent être vérifiées ou reproduites avec un autre système d’imagerie spectrale, annulant ainsi efficacement les conclusions tirées avec ces données. Parmi ces étapes importantes, il y a la correction de la sortie s…

Discussion

L’utilisation optimale d’une imagerie hyperspectrale à balayage d’excitation commence par la construction du chemin lumineux. En particulier, le choix de la source lumineuse, des filtres (tunable et dichroic), de la méthode de commutation de filtre, et de la caméra déterminent la gamme spectrale disponible, la vitesse possible de balayage, la sensibilité de détecteur, et l’échantillonnage spatial. Les lampes à arc de mercure offrent de nombreux pics de longueur d’onde d’excitation, mais ne fournissent pas une sor…

Materials

Airway Smooth Muscle Cells	National Disease Research Interchange (NDRI)	Isolated from human lung tissues obtained from NDRI	Highly autofluorescent, calcium sensitive cells
Automated Shutter	Thorlabs Inc.	SHB1	Remote-controllable shutter to minimize photobleaching
Automated Stage	Prior Scientific	H177P1T4	Remote-controllable stage for automated multiple field of view or stitched image collection.
Automated Stage Controller (XY)	Prior Scientific	Proscan III (H31XYZE-US)	For interfacing automated stage with computer and joystick
Buffer	Made in-house	Made in-house	145 mM NaCl, 4 mM KCl, 20 mM HEPES, 10 mM D-glucose, 1 mM MgCl2, and 1mM CaCl2, at pH 7.3
Cell Chamber	ThermoFisher Scientific	Attofluor Cell Chamber, A7816	Coverslip holder composed of surgical stainless steel and a rubber O-ring to seal in media and prevent sample and/or objective contamination
Excitation Filters	Semrock Inc.	TBP01-378/16	Center wavelength range (340-378 nm), Bandwidth (Minimum 16 nm, nominal FWHM 20 nm), Refractive index (1.88)
	Semrock Inc.	TBP01-402/16	Center wavelength range (360-400 nm), Bandwidth (Minimum 16 nm, nominal FWHM 20 nm), Refractive index (1.8)
	Semrock Inc.	TBP01-449/15	Center wavelength range (400-448.8 nm), Bandwidth (Minimum 15 nm, nominal FWHM 20 nm), Refractive index (1.8)
	Semrock Inc.	TBP01-501/15	Center wavelength range (448.8-501.5 nm), Bandwidth (Minimum 15 nm, nominal FWHM 20 nm), Refractive index (1.84)
	Semrock Inc.	TBP01-561/14	Center wavelength range (501.5-561 nm), Bandwidth (Minimum 14 nm, nominal FWHM 20 nm), Refractive index (1.83)
Fluorescence Filter Cube Dichroic Beamsplitter	Semrock Inc.	FF495-Di03	Separates excitation and emission light at 495 nm (>98% reflection between 350-488 nm, >93% transmission between 502-950 nm), Filter effective index (1.78)
Fluorescence Filter Cube Longpass Filter	Semrock Inc.	FF01 496/LP-25	Allows passage of light longer than 496 nm ( >93% average transmission between 503.2-1100 nm), Refractive index (1.86)
GCaMP Probe	Addgene	G-CaMP3; Plasmid #22692	A single-wavelength GCaMP2-based genetically encoded calcium indicator
Integrating Sphere	Ocean Optics	FOIS-1	Used for accurate measurement of wide-angle illumination
Inverted Fluorescence Microscope	Nikon Instruments	TE2000	Inverted microscopes allow direct excitation of sample without the need to penetrate layers of media and/or tissue.
Mitotracker Green FM	ThermoFisher Scientific	M7514	Labels mitochondria
NIST-Traceable Calibration Lamp	Ocean Optics	LS-1-CAL-INT	A lamp with a known spectrum for use as a standard
NIST-Traceable Fluorescein	ThermoFisher Scientific	F36915	For verifying appropriate spectral response of the system
NucBlue	ThermoFisher Scientific	R37605	Labels cell nuclei
Objective (10X)	Nikon Instruments	Plan Apo λ 10X/0.45 ∞/0.17 MRD00105	Useful for large fields of view
Objective (20X)	Nikon Instruments	Plan Apo λ 20X/0.75 ∞/0.17 MRD00205	Most often used for tissue samples
Objective (60X)	Nikon Instruments	Plan Apo VC 60X/1.2 WI ∞/0.15-0.18 WD 0.27	Most often used for cell samples
sCMOS Camera	Photometrics	Prime 95B (Rev A8-062802018)	For acquiring high-sensitivity digital images
Spectrometer	Ocean Optics	QE65000	Used to measure spectral output of excitation-scanning spectral system
Tunable Filter Changer	Sutter Instrument	Lambda VF-5	Motorized unit for automated excitation filter tuning/switching
Xenon Arc Lamp	Sunoptic Technologies	Titan 300HP Lightsource	Light source with relatively uniform spectral output