Microscopia de imagem hiperespectral de detecção de excitação para discriminar sinais de fluorescência de forma eficiente

Summary

A imagem latente espectral transformou-se uma solução de confiança para a identificação e a separação de sinais múltiplos da fluorescência em uma única amostra e pode prontamente distinguir sinais do interesse do fundo ou do autofluorescence. A excitação-a imagem latente hiperespectrais da exploração melhora nesta técnica diminuindo o tempo necessário da aquisição da imagem ao simultaneamente aumentar a relação do sinal-à-ruído.

Abstract

Várias técnicas dependem da detecção de sinais de fluorescência para identificar ou estudar fenômenos ou para elucidar funções. A separação destes sinais da fluorescência foi provada complicada até o advento da imagem latente hiperespectrais, em que as fontes da fluorescência podem ser separadas de se e de sinais do fundo e do autofluorescence (dado o conhecimento de seu espectral assinaturas). Entretanto, a imagem latente hiperespectrais tradicional, da emissão-exploração sofre dos tempos lentos da aquisição e das baixas relações do sinal-à-ruído devido à filtração necessária da excitação e da luz da emissão. Foi mostrado previamente que a imagem latente hiperespectrais da excitação-exploração reduz o tempo necessário da aquisição ao simultaneamente aumentar a relação sinal-à-ruído de dados adquiridos. Usando equipamentos comercialmente disponíveis, este protocolo descreve como montar, calibrar e usar um sistema de microscopia de imagem hiperespectral de varredura de excitação para a separação de sinais de várias fontes de fluorescência em uma única amostra. Quando altamente aplicável à imagem latente microscópica das pilhas e dos tecidos, esta técnica pode igualmente ser útil para qualquer tipo de experiência que utiliza a fluorescência em que é possível variar comprimentos de onda da excitação, incluindo mas não limitado a: imagem latente química, aplicações ambientais, cuidados com os olhos, ciência dos alimentos, ciência forense, ciência médica e mineralogia.

Introduction

A imagem latente espectral pode ser executada em uma variedade de maneiras e é referida por diversos termos^1,2,3,4. Em geral, a imagem espectral refere-se aos dados adquiridos em pelo menos duas dimensões espaciais e uma dimensão espectral. A imagem latente Multispectral e hiperespectrais é distinguida o mais frequentemente pelo número de faixas do comprimento de onda ou se as faixas espectrais são contíguas¹. Para esta aplicação, os dados hiperespectrais são definidos como os dados espectrais adquiridos com as faixas contíguas do comprimento de onda conseguidas pelo afastamento de comprimentos de onda Center não menos do que a metade da largura cheia no meio máximo (FWHM) de cada filtro do bandpass usado para a excitação (isto é, 5 nanômetro espaçamento de comprimento de onda Center para filtros de banda com larguras de banda 14-20 nm). A natureza contígua das bandas de dados permite um excesso de amostragem do conjunto, assegurando que os critérios de Nyquist são satisfeitos ao amostrando o domínio espectral.

A imagem latente Hyperspectral foi desenvolvida por NASA nos 1970s e nos 1980s conjuntamente com o primeiro satélite Landsat^5,6. A coleta de dados de várias bandas espectrais contíguas permitiu a geração de um espectro de radiância de cada pixel. Identificar e definir o espectro de radiância de componentes individuais permitiu não só detectar materiais de superfície por seus espectros característicos, mas também permitiu a remoção de sinais intervenientes, como variações no sinal devido à condições atmosféricas. O conceito de detecção de materiais utilizando seus espectros característicos foi aplicado em sistemas biológicos em 1996 quando Schröck et al. utilizaram combinações de cinco diferentes fluoróforos e seus espectros conhecidos para distinguir os cromossomas rotulados em um processo denominado Karyotyping espectral⁷. Esta técnica foi elaborada em 2000 por Tsurui et al. para a imagem latente da fluorescência de amostras do tecido, usando sete tinturas fluorescentes e a decomposição singular do valor para conseguir a separação espectral de cada pixel em combinações lineares dos espectros na referência na biblioteca⁸. Semelhante a seus homólogos de sensoriamento remoto, a contribuição de cada fluoróforo conhecido pode ser calculada a partir da imagem hiperespectral, dada a priori informações do espectro de cada fluoróforo.

A imagem latente de Hyperspectral foi usada igualmente nas áreas da^{agricultura 9},^{astronomia 10}, biomedicina¹¹, imagem latente química¹², aplicações ambientais¹³, cuidado¹⁴do olho, ciência de alimento¹⁵, ciência forense¹⁶,¹⁷, ciência médica¹⁸, mineralogia¹⁹e vigilância²⁰. Uma limitação chave de sistemas de imagem latente hiperespectrais do microscópio de fluorescência atual é que a tecnologia de imagem latente hiperespectrais padrão isola sinais da fluorescência em bandas estreitas por 1) primeiramente filtrando a luz da excitação para controlar a excitação da amostra, a seguir 2) mais adicional que filtra a luz emitida para separar a emissão da fluorescência em faixas estreitas que podem mais tarde ser separadas matematicamente²¹. Filtrar a iluminação da excitação e a fluorescência emitida reduzem a quantidade de sinal disponível, que abaixa a relação sinal-à-ruído e necessita tempos de aquisição longos. O sinal baixo e os tempos longos da aquisição limitam a aplicabilidade da imagem latente hiperespectrais como uma ferramenta diagnóstica.

Uma modalidade da imagem latente foi desenvolvida que empreuse da imagem latente hiperespectrais mas impulsiona o sinal disponível, reduzindo desse modo o tempo necessário da aquisição^21,22. Esta modalidade nova, chamada imagem latente hiperespectrais da excitação-exploração, adquire dados espectrais da imagem variando o comprimento de onda da excitação e coletando uma escala larga da luz emitida. Tem sido demonstrado anteriormente que esta técnica produz aumentos de ordem de magnitude na relação sinal/ruído em comparação com as técnicas de digitalização de emissões^21,22. O aumento na relação sinal-ruído é em grande parte devido ao bandpass largo (~ 600 nanômetro) da luz de emissão detectada, quando a especificidade for fornecida filtrando somente a luz da excitação em vez da emissão da fluorescência. Isto permite que toda a luz emitida (para cada comprimento de onda da excitação) alcangue o detetor²¹. Adicionalmente, esta técnica pode ser usada para discriminar a autofluorescência de rótulos exógenos. Além disso, a capacidade de reduzir o tempo de aquisição devido ao aumento do sinal detectável reduz o perigo de fotobranqueamento, bem como permite varreduras espectrais a uma taxa de aquisição que é aceitável para imagens de vídeo espectral.

O objetivo deste protocolo é servir como um guia de aquisição de dados para a microscopia de imagem hiperespectral de varredura de excitação. Além disso, as descrições são incluídas que ajudam a entender o caminho de luz e hardware. Também é descrita a implementação de software de código aberto para um microscópio de imagem hiperespectral de varredura de excitação. Por fim, são fornecidas descrições sobre como calibrar o sistema para um padrão rastreável pelo NIST, ajustar as configurações de software e hardware para obter resultados precisos e desmisturar o sinal detectado em contribuições de componentes individuais.

Protocol

1. dispositivo de set-up Fonte luminosa: selecione uma fonte luminosa espectral da largo-faixa com saída de poder superior e colimação elevada (uma lâmpada de arco de 300 W xe foi usada para estes estudos). Obturador (opcional): Adicione um obturador ao caminho óptico para reduzir o fotobranqueamento para imagens de lapso de tempo. Sistema ajustável do filtro: incorpore um conjunto de ajustamento mecânico e um filtro sintonizável da fino-película (TFTF) ajustado para permitir a esca…

Representative Results

Várias etapas importantes deste protocolo são necessárias para garantir a coleta de dados que são precisos e desprovidos de imagens e artefatos espectrais. Pular essas etapas pode resultar em dados que parecem significativos, mas não podem ser verificados ou reproduzidos com qualquer outro sistema de imagens espectrais, anulando assim efetivamente quaisquer conclusões feitas com esses dados. O chefe entre estas etapas importantes é a correção de saída espectral adequada (seção…

Discussion

O uso ideal de uma configuração de imagem hiperespectral de excitação-digitalização começa com a construção do caminho de luz. Em particular, a escolha da fonte luminosa, dos filtros (ajustáveis e dichroic), do método do interruptor do filtro, e da câmera determina a escala espectral disponível, a velocidade possível da varredura, a sensibilidade do detector, e a amostragem espacial. As lâmpadas de arco de mercúrio oferecem muitos picos de comprimento de onda de excitação, mas não fornecem uma saída e…

Materials

Airway Smooth Muscle Cells	National Disease Research Interchange (NDRI)	Isolated from human lung tissues obtained from NDRI	Highly autofluorescent, calcium sensitive cells
Automated Shutter	Thorlabs Inc.	SHB1	Remote-controllable shutter to minimize photobleaching
Automated Stage	Prior Scientific	H177P1T4	Remote-controllable stage for automated multiple field of view or stitched image collection.
Automated Stage Controller (XY)	Prior Scientific	Proscan III (H31XYZE-US)	For interfacing automated stage with computer and joystick
Buffer	Made in-house	Made in-house	145 mM NaCl, 4 mM KCl, 20 mM HEPES, 10 mM D-glucose, 1 mM MgCl2, and 1mM CaCl2, at pH 7.3
Cell Chamber	ThermoFisher Scientific	Attofluor Cell Chamber, A7816	Coverslip holder composed of surgical stainless steel and a rubber O-ring to seal in media and prevent sample and/or objective contamination
Excitation Filters	Semrock Inc.	TBP01-378/16	Center wavelength range (340-378 nm), Bandwidth (Minimum 16 nm, nominal FWHM 20 nm), Refractive index (1.88)
	Semrock Inc.	TBP01-402/16	Center wavelength range (360-400 nm), Bandwidth (Minimum 16 nm, nominal FWHM 20 nm), Refractive index (1.8)
	Semrock Inc.	TBP01-449/15	Center wavelength range (400-448.8 nm), Bandwidth (Minimum 15 nm, nominal FWHM 20 nm), Refractive index (1.8)
	Semrock Inc.	TBP01-501/15	Center wavelength range (448.8-501.5 nm), Bandwidth (Minimum 15 nm, nominal FWHM 20 nm), Refractive index (1.84)
	Semrock Inc.	TBP01-561/14	Center wavelength range (501.5-561 nm), Bandwidth (Minimum 14 nm, nominal FWHM 20 nm), Refractive index (1.83)
Fluorescence Filter Cube Dichroic Beamsplitter	Semrock Inc.	FF495-Di03	Separates excitation and emission light at 495 nm (>98% reflection between 350-488 nm, >93% transmission between 502-950 nm), Filter effective index (1.78)
Fluorescence Filter Cube Longpass Filter	Semrock Inc.	FF01 496/LP-25	Allows passage of light longer than 496 nm ( >93% average transmission between 503.2-1100 nm), Refractive index (1.86)
GCaMP Probe	Addgene	G-CaMP3; Plasmid #22692	A single-wavelength GCaMP2-based genetically encoded calcium indicator
Integrating Sphere	Ocean Optics	FOIS-1	Used for accurate measurement of wide-angle illumination
Inverted Fluorescence Microscope	Nikon Instruments	TE2000	Inverted microscopes allow direct excitation of sample without the need to penetrate layers of media and/or tissue.
Mitotracker Green FM	ThermoFisher Scientific	M7514	Labels mitochondria
NIST-Traceable Calibration Lamp	Ocean Optics	LS-1-CAL-INT	A lamp with a known spectrum for use as a standard
NIST-Traceable Fluorescein	ThermoFisher Scientific	F36915	For verifying appropriate spectral response of the system
NucBlue	ThermoFisher Scientific	R37605	Labels cell nuclei
Objective (10X)	Nikon Instruments	Plan Apo λ 10X/0.45 ∞/0.17 MRD00105	Useful for large fields of view
Objective (20X)	Nikon Instruments	Plan Apo λ 20X/0.75 ∞/0.17 MRD00205	Most often used for tissue samples
Objective (60X)	Nikon Instruments	Plan Apo VC 60X/1.2 WI ∞/0.15-0.18 WD 0.27	Most often used for cell samples
sCMOS Camera	Photometrics	Prime 95B (Rev A8-062802018)	For acquiring high-sensitivity digital images
Spectrometer	Ocean Optics	QE65000	Used to measure spectral output of excitation-scanning spectral system
Tunable Filter Changer	Sutter Instrument	Lambda VF-5	Motorized unit for automated excitation filter tuning/switching
Xenon Arc Lamp	Sunoptic Technologies	Titan 300HP Lightsource	Light source with relatively uniform spectral output