Summary
L'analyse multilocus à répétition en tandem (MLVA) présentée ici permet un génotypage à haute résolution peu coûteux, robuste et portable de la bactérie poisson-pathogène Yersinia ruckeri. Partant de cultures pures, l'essai utilise le multiplex PCR et l'électrophoresis capillaire pour produire des profils MLVA à dix loci pour des applications en aval.
Abstract
Yersinia ruckeri est un agent pathogène important des salmonidés d'élevage dans le monde entier, mais des outils simples adaptés aux investigations épizootiologiques (traçage des infections, etc.) de cette bactérie ont fait défaut. Un essai multi-Locus variable-numéro d'analyse de tandem-répétition (MLVA) a donc été développé comme outil facilement accessible et sans ambiguïté pour le génotypage à haute résolution des isolats récupérés. Pour l'analyse MLVA présentée ici, l'ADN est extrait d'échantillons de Y. ruckeri cultivés par l'ébullition des cellules bactériennes dans l'eau, suivie de l'utilisation de supernatant comme modèle pour PCR. Les paires d'amorces ciblant dix loci à répétition en tandem à nombre variable (VNTR), entrecoupées dans tout le génome de Y. ruckeri, sont réparties également entre deux réactions PCR à cinq plex qui se produisent dans des conditions de cyclisme identiques. Les amorces avant sont étiquetées avec l'un ou l'autre des trois colorants fluorescents. Après confirmation d'amplicon par l'électrophoresis de gel, les produits de PCR sont dilués et soumis à l'électrophoresis capillaire. À partir des profils d'électrophéromiques qui en résultent, les pics représentant chacun des loci VNTR sont appelés taille et utilisés pour calculer les comptes de répétition VNTR en silico. Les profils MLVA à dix chiffres qui en résultent sont ensuite utilisés pour générer des arbres à enjambement minimum permettant une évaluation épizootiologique par analyse des grappes. Les données de sortie très portables, sous forme de profils numériques MLVA, peuvent être rapidement comparées entre les laboratoires et placées dans un contexte spatiotemporel. La procédure entière de la colonie cultivée à l'évaluation épizootiologique peut être accomplie pour jusqu'à 48 isolats de ruckeri de Y. dans une seule journée de travail.
Introduction
Yersinia ruckeri, une bactérie Gram-négative et membre de la famille Yersiniaceae, provoque la yersiniose dans les poissons salmonidés d'élevage dans le monde entier1. Il est facilement diagnostiqué à partir de poissons infectés par la culture sur de nombreux types de médias d'agar, mais jusqu'à récemment, peu de choses étaient connues concernant la structure de la population et l'épizootiologie de Y. ruckeri à travers le monde et dans différents habitats (espèces hôtes, etc.). Les systèmes de sérotypage existants pour Y. ruckeri sont incohérents, manquent de compatibilité mutuelle et offrent une faible résolution épidémiologique. Certaines études moléculaires sur la bactérie ont été menées, utilisant des techniques telles que la dactylographie de séquence multilocus (MLST), l'électrophoresis de gel pulsé (PFGE) ou l'analyse de séquence de génome entier (WGS)2,3,4 ,5. Cependant, MLST ne fournit pas une résolution suffisamment élevée pour le traçage courant des infections, tandis que PFGE est exigeant en main-d'œuvre et produit des résultats qui ne sont pas facilement portables à travers les laboratoires. Bien que l'analyse du SG Fournirait une résolution presque ultime, l'établissement et la mise en œuvre de telles analyses conditionnels aux capacités techniques et bioinformatiques qui restent encore limitées à un nombre relativement restreint de laboratoires.
Multi-locus Variable-nombre tandem-repeat Analysis (MLVA) représente un outil de dactylographie moléculaire simple et facilement accessible, qui offre une résolution génétique dans certains cas presque correspondant à celle de l'analyse WGS6,7. La technique est basée sur la variation répétée du nombre de loci à répétition de tandems (VNTR) à nombre variable, ce qui donne des données de sortie très transportables, ce qui rend la comparaison des isolats profilés vers les bases de données en ligne et entre les laboratoires. Bien que la MLST demeure l'étalon-or pour le dactylographie épidémiologique de nombreux agents pathogènes bactériens, un nombre croissant d'études identifient un pouvoir discriminatoire significativement plus élevé de MLVA8,9,10. Plusieurs protocoles ont également été publiés ciblant les bactéries poisson-pathogène, telles que Francisella noatunensis, Edwardsiella piscicida et Renibacterium salmoninarum11,12, 13.
Le protocole MLVA de dix loci présenté ici, qui a récemment formé la base d'une étude étendue de population de Y. ruckeri 14,implique l'extraction de l'ADN des colonies agar-cultivées, du PCR multiplex et de l'électrophorèse capillaire (CE), suivi de l'aval dans les applications silico. Pour chaque isolat examiné, deux RPC multiplex, tous deux contenant cinq paires d'amorces fluorescentes (6FAM, NED ou VIC) ciblant chacune les régions VNTR individuelles, sont exécutés en parallèle dans des conditions identiques. Après vérification des amplicônes DE PCR par électrophorèse de gel (GE), les produits de PCR sont dilués avant l'analyse de CE, et les pics représentant les loci respectifs de VNTR sont la taille-appelée des fichiers d'électrophéromographie résultants. En plus des formules spécifiques au locus qui tiennent compte des écarts mineurs et spécifiques à la séquence dans les modèles migratoires DE, les appels de taille ce vNTR sont ensuite utilisés pour calculer les nombres de répétitions VNTR qui sont regroupés en profils MLVA à dix chiffres. Ceux-ci sont utilisés comme entrée pour des évaluations épizootiologiques (p. ex., par analyse des grappes dans des diagrammes d'arbres à enjambement minimum (MST).
Protocol
CAUTION: Pour l'ensemble du protocole, il est conseillé d'effectuer toutes les procédures de laboratoire humide stérilement en l'utilisation de blouses de laboratoire, gants jetables et réactifs stériles et de l'équipement. Il est également conseillé de préparer les réactions PCR dans une pièce séparée (pré-PCR) non utilisée pour l'amplification et/ou la manipulation des PCR (post-PCR). Entreposez tous les réactifs comme le recommande le fabricant. Voir Tableau des matériaux pour plus de détails sur les réactifs, l'équipement et les logiciels utilisés.
1. Cultivation bactérienne et extraction de l'ADN génomique
- Semez les cultures pures Y. ruckeri sur n'importe quel type d'agar approprié (les auteurs ont utilisé 5% d'agar de sang bovin) et couve à 22 oC pendant 1-2 jours, ou 15 oC pendant 3-4 jours.
- Dans chaque plaque d'agar, choisissez une seule colonie représentative avec une boucle d'inoculation et transférez-les dans des tubes centrifugeuses de 1,5 ml contenant 50 l d'eau ultrapurifiée. Suspendre, vortex brièvement, et incuber pendant 7 min sur un bloc de chauffage à 100 oC.
- Centrifugeuse à 16 000 x g pendant 3 min et utiliser une pipette pour transférer soigneusement le supernatant dans un tube vide de centrifugeuse de 1,5 ml. Passez à l'étape suivante en utilisant le supernatant comme modèle d'ADN ou entreposez-le à -20 oC jusqu'à ce que ce soit.
2. Configuration multiplex PCR et Conditions de cyclisme
REMARQUE: Chaque réaction multiplex PCR (deux par isolat Y. ruckeri) doit contenir 12,5 L de mix principal 2x Multiplex PCR Plus, 0,1 à 0,2 M de chaque paire d'amorce appropriée (tableau 1) et 3 l d'ADN de modèle, ajusté à un volume de réaction final de 25 l par ajout d'eau sans RNase. Viser à maintenir l'exposition légère des amorces avant étiquetées fluorescentes à un minimum (p. ex., en enveloppant leurs tubes de rangement dans du papier d'aluminium).
- Pour chacun des deux essais de PCR multiplex (tableau 1), préparez les mélanges principaux tels que décrits ci-dessus (sans ADN de modèle) en fonction du nombre d'échantillons plus un contrôle positif et négatif. De plus, prévoyez un volume excédentaire de 10 %. Vortex le maître préparé se mélange doucement à basse vitesse.
- Distribuer 22 L de chaque mélange maître séparément dans des puits individuels sur des bandes ou des plaques PCR, le cas échéant pour le nombre d'échantillons, et ajouter 3 l de modèle à chaque puits (pour des contrôles positifs et négatifs, respectivement, utiliser l'ADN d'un Y. ruckeri vérifié l'eau ultrapurifiée). Sceau et centrifugeuse brièvement.
- Exécuter tous les échantillons sur un cycleur thermique PCR avec le programme suivant : (i) 5 min à 95 oC (ii) 30 cycles de 0,5 min à 95 oC, 1,5 min à 60 oC et 1 min à 72 oC, et (iii) 60 min à 68 oC, suivi d'un refroidissement à 4 oC indéfiniment. Le programme se terminera en moins de 3 h.
3. CONFIRMATION pcR Amplicon par Gel Electrophoresis
- Selon les recommandations du fabricant, préparer un volume de 1,5 % (w/v) gel d'agarose dans un tampon 1x tris-borate-EDTA (TBE) approprié pour le nombre de réactions PCR à tester. Avant la coulée, ajouter 5 ll de colorant en acide nucléique fluorescent par 50 l de solution de gel et mélanger. Utilisez des plateaux et des peignes comme approprié pour la coulée, en laissant un nombre approprié de puits libres pour les échelles de référence en ADN.
- Après le réglage, immerger le gel dans 1x TBE-buffer dans un système GE. Mélanger 5 L de produit PCR avec 2 l l de colorant de chargement et transférer dans des puits de gel. Ajouter 5 ll d'échelle d'ADN dans des puits vides pour référence.
- Faites fonctionner le gel à 110 V par 15 cm pendant environ 1 h et utilisez un système d'imagerie/visualisation de gel à base d'UV pour vérifier la présence de plusieurs bandes (jusqu'à cinq) représentant des amplicônes PCR (voir exemple à la figure 1). Jetez le gel. Passez à l'étape suivante ou entreposez les produits PCR restants à 4 oC jusqu'à ce que le traitement se poursuive.
4. Conditions d'aménagement et de course d'électrophorèse capillaires
- Après confirmation des amplicons PCR, diluer les produits PCR 1:10 (v/v) dans de l'eau purifiée. Sceller, mélanger et centrifuger brièvement.
- En travaillant dans un placard à fumées, préparer un volume de mélange maître composé de 9 l de formamide et de 0,5 L de taille standard par produit PCR (permettre un volume excédentaire de 10 %). Vortex brièvement et distribuer 9,5 L dans des puits sur une plaque appropriée pour le système CE disponible, avant d'ajouter 0,5 L de produit PCR dilué. Sceller, mélanger et centrifuger brièvement.
MISE EN GARDE: Manipulez avec soin. Le mélange du formamide avec de l'eau génère de l'acide formique, qui est toxique. - À l'aide d'un cycleur thermique PCR, dénaturer les échantillons à 95 oC pendant 3 min avant de les refroidir à 4 oC indéfiniment. Centrifugeuse brièvement et chargez la plaque sur un système CE calibré selon les instructions du fabricant.
- Exécuter l'analyse des fragments CE à l'aide de réactifs appropriés pour l'appareil de choix et les réglages suivants : 60 oC; 5 injections à 1,6 kV (32 V par cm); Temps de course de 32 min à 15 kV (300 V par cm). L'analyse du fragment de CE de 24 puits sur un 24-capillaire (50 cm) prendra généralement environ 50 min.
5. Appel de taille VNTR, calcul du nombre de répétitions et profilage MLVA
REMARQUE: L'étape 5.1 décrit y. ruckeri VNTR CE taille appelant à partir de fichiers électrophériques, en utilisant le logiciel spécifique énuméré sa liste dans tableau des matériaux. Consultez le manuel logiciel pour plus de détails et de dépannage. Pour l'utilisation d'autres logiciels, consultez les manuels appropriés.
-
Importer les fichiers de résultats CE (deux par isolat Y. ruckeri). Définir la méthode d'analyse par défaut microsatellite et sélectionnez le choix de produit approprié sous la norme de taille, avant d'appuyer sur le bouton Analyse. Vérifier l'identification correcte des fragments standard de taille à travers l'éditeur de taille match et corriger toute allocation visiblement erronée.
- Après avoir sélectionné l'échantillon (s) à lire, appuyez sur le bouton Affichage Plots et appuyez sur Ctrl-A pour activer la vue de la table de dimensionnement. Dans le panneau supérieur, maintenez Ctrl en cliquant sur les cinq pics représentant les amplicons VNTR (utiliser l'outil de zoom au besoin).
REMARQUE: Pour chacun des produits multiplex PCR, l'électrophétogramme montrera cinq pics répartis entre les trois colorants utilisés (voir 5' étiquetage teinture des amorces avant dans le tableau 1 et les deux exemples de la figure 2). - Appuyez sur Ctrl-G pour filtrer la table de dimensionnement, ne montrant que les caractéristiques des cinq pics mis en évidence, et enregistrez les appels de taille CE pour chaque locus VNTR (en référence au tableau 1) pour l'application en aval.
- Après avoir sélectionné l'échantillon (s) à lire, appuyez sur le bouton Affichage Plots et appuyez sur Ctrl-A pour activer la vue de la table de dimensionnement. Dans le panneau supérieur, maintenez Ctrl en cliquant sur les cinq pics représentant les amplicons VNTR (utiliser l'outil de zoom au besoin).
- Afin de tenir compte des modèles biaisés de mobilité des amplicons pendant le CE, calculez des comptes de répétition VNTR précis selon la formule fournie ci-dessous, en utilisant des appels de taille VNTR CE ainsi que des variables spécifiques au locus (voir le tableau 1). Pour plus d'efficacité, il est conseillé d'automatiser ce processus (par exemple, à l'aide d'un modèle de feuille de calcul).
- La répétition VNTR calculée en rond compte à l'entiereteur le plus proche et se concatenate en cordes à dix chiffres, chacune représentant le profil MLVA d'un seul isolat Y. ruckeri.
6. Analyse minimale des grappes d'arbres de MLVA
REMARQUE: L'étape 6 décrit la création de diagrammes MST à partir des données Y. ruckeri MLVA, à l'aide du logiciel spécifique énuméré dans tableau des matériaux. Consultez le manuel logiciel pour plus de détails et de dépannage. Pour l'utilisation d'autres logiciels, consultez les manuels appropriés.
- Créez une nouvelle base de données et optez pour activer le plugin MLVA.
- Importer les profils et métadonnées Y. ruckeri MLVA en sélectionnant les données de type Caractère suivies des champs et des caractères d'importation (plus de sous-sélection selon le format de stockage). Lorsque vous êtes invité, spécifiez les règles d'importation en fonction du contenu du fichier d'importation : Dans la colonne de type Destination, classez les comptes de répétition VNTR comme valeur de caractère : VNTR, et les métadonnées diverses comme informations d'entrée : Champ d'informations d'entrée .
REMARQUE: Pour la comparaison et le contexte, il est également possible d'importer l'ensemble des données publiées (accès libre) ainsi que le papier original utilisant le protocole MLVA actuel14. Les profils MLVA et les métadonnées sur la collection variée d'isolats Y. ruckeri (n ' 484) examinés dans cette étude sont disponibles à partir de son matériel supplémentaire (tableaux S1 et S2) par le biais du lien suivant : https://aem.asm.org/content/84/16/e00730-18/figures-only#fig-data-additional-files - Dans le panneau de type Expérience, ouvrez l'entrée VNTR et fixez des valeurs minimales et maximales pour chaque locus VNTR à 0 et 100, respectivement. Dans les paramètres généraux, définir le nombre de chiffres décimal s'agitder de 0 et sélectionner des nombres sous type De données. Vérifiez que les valeurs absentes sont nulles.
-
Sélectionnez les échantillons importés destinés à l'analyse des grappes MST et cliquez sur le bouton Créer un nouveau bouton de comparaison (en panneau de comparaison).
- Si vous le souhaitez pour la présentation visuelle du TMS, répartir les échantillons à des groupes de couleur (p. ex., selon un trait de métadonnées particulier) en utilisant les différentes options disponibles dans le panel Groupes.
REMARQUE: Les groupes peuvent également être créés/modifiés rétrospectivement, après les étapes suivantes. - Sélectionnez l'analyse avancée des grappes... et mST pour les données catégoriques afin de générer un diagramme MST basé sur les échantillons choisis.
- Modifier davantage la présentation visuelle du MST selon la préférence (p. ex., en ajoutant des paramètres de partitionnement, un étiquetage noeud/branche, des liens croisés, des légendes, etc.). Voir l'exemple dans la figure 3.
REMARQUE: Un seuil de partitionnement de cluster (complexe clonal) de 4/10 loci VNTR non identiques, en plus de cacher les connexions de branche représentant les loci VNTR non identiques, a déjà été utilisé pour l'analyse des grappes MST basée sur les données MLVA générées en utilisant ce protocole14. À condition que l'ensemble de données susmentionné de 484 profils Y. ruckeri MLVA soit importé, ces échantillons peuvent également être inclus pour l'analyse des grappes MST (comme décrit ci-dessus) afin de fournir un contexte global et historique. Cela facilitera, par exemple, l'identification de tous les échantillons affiliés à des complexes clonaux décrits antérieurement, ainsi que ceux représentant des lignées encore non décrites. Selon les métadonnées disponibles, le diagramme MST qui en résulte peut être examiné de différentes manières, par exemple pour découvrir d'éventuels modèles de regroupement liés à des traits particuliers (géographie, hôte, temps, etc.). - Si nécessaire, exportez le MST finalisé dans un format souhaité à l'aide de la sélection d'images Export.
- Si vous le souhaitez pour la présentation visuelle du TMS, répartir les échantillons à des groupes de couleur (p. ex., selon un trait de métadonnées particulier) en utilisant les différentes options disponibles dans le panel Groupes.
Representative Results
Après multiplex PCR tel que décrit ici, une image ge typique vérifiant la présence de plusieurs amplicons de chaque réaction PCR est montrée dans la figure 1. L'analyse des fragments de CE en aval effectuée sur des produits PCR vérifiés permettra, pour chaque isolat De Y. ruckeri examiné, de produire deux fichiers d'électrophéromographie utilisés pour l'appel de taille du loci VNTR respectif (figure 2). De l'analyse de 484 isolats divers de Y. ruckeri, aucun chevauchement dans la gamme de taille d'amplicon n'a été observé entre les loci vNTR étiquetés avec le même colorant dans la même réaction multiplexe (tableau 1)14. Chacun des pics électrophoretiques peut, par conséquent, être identifié sans ambiguïté par la couleur.
À la suite de l'importation de profils MLVA et de métadonnées pertinentes dans le logiciel préféré, les diagrammes MST peuvent être construits comme décrits pour l'examen de tout modèle épidémiologique d'intérêt dans le matériel. Consultez les manuels appropriés pour les options supplémentaires disponibles dans le logiciel respectif. À titre d'exemple, la figure 3 montre la comparaison par MST des profils MLVA pour les isolats De Y. ruckeri récupérés à partir de poissons associés à cinq fermes salmonicoles différentes en Norvège.
Les tailles de répétition cohérentes des dix loci VNTR, ainsi que leur stabilité in vitro et in vivo, ont déjà été vérifiées dans l'étude originale basée sur ce protocole14. En bref, cela a été fait en utilisant le séquençage Sanger (taille de répétition), et par mLVA tapant de multiples isolats suivant des passages en série (in vitro) et de l'intérieur des éclosions de maladies individuelles (in vivo). De plus, la stabilité environnementale des loci au fil du temps a été examinée en tapant plusieurs isolats de « souche de maison » récupérés sur plusieurs années dans des sites de production d'eau douce infectés de façon persistante pour le saumon de l'Atlantique.
Figure 1 : Gel électrophoresis vérifiant la présence de plusieurs produits PCR. L'image confirme la présence de plusieurs amplicons PCR dans les 12 voies contenant des échantillons, la première voie représentant l'échelle d'ADN utilisée. Les tailles des fragments d'échelle sélectionnés ont été indiquées, de même que l'épreuve et la souche PCR (voir tableau S1 dans Gulla et al. 201814) affiliation de chaque voie. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Électrophéromies montrant des pics correspondant aux amplicons VNTR. Les noms des différents loci VNTR sont indiqués, avec des étiquettes de colorant (VIC vert; NED - noir; 6FAM et bleu) entre parenthèses. Les deux électrophétographies (PCR assay 1 top; PCR test 2 bottom) proviennent de la saisie d'un seul isolat Y. ruckeri. Les pics oranges (dye LIZ) représentent la norme de taille utilisée. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 : Exemple Arbre d'enjambement minimal pour l'évaluation épidémiologique. Le diagramme est basé sur les profils MLVA des isolats de Y. ruckeri récupérés sur le saumon de l'Atlantique dans cinq fermes norvégiennes différentes (1-5; voir légende) qui connaissent des flambées récurrentes de yerisniose. On peut observer une nette tendance à l'amas lié à l'origine de la ferme. Les liaisons transversales montrent toutes les connexions possibles impliquant 1/10 loci VNTR non identiques (voir légende). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4 : Électrophétogramme visualisant le bégaiement et les pics fendus. Dans ce cas, les deux se produisent simultanément, ce qui n'est pas toujours le cas. Le pic plus long et plus grand, représentant le locus YR1070 VNTR, peut être facilement distingué. L'écran est agrandi et ne montre que des pics de teinture bleue. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Tableau 1 : Caractéristiques du locus VNTR. Caractéristiques pertinentes des dix régions Y. ruckeri VNTR visées par le protocole MLVA actuel.
Discussion
Les deux PCR multiplex présentés ici sont apparus relativement robustes face à la mauvaise qualité de l'ADN modèle, mais l'absence d'amplification DE PCR a néanmoins été occasionnellement observée lors de l'utilisation de modèles avec des concentrations d'ADN extrêmement élevées. Ces problèmes ont été facilement résolus en diluant les modèles avant PCR. D'autres méthodes d'extraction de l'ADN que celle utilisée ici peuvent également être utilisées (p. ex., des trousses commerciales).
Bien que cinq amplicons soient attendus de chaque réaction de PCR multiplex, cinq bandes visuellement distinguables ne devraient pas toujours être attendues de GE, car certains loci VNTR (différemment étiquetés) dans la même réaction ont des gammes de taille qui se chevauchent. Le délai final d'extension du PCR de 60 min peut être raccourci si nécessaire, mais il est probable qu'il en résultera une augmentation de la fréquence des pics fractionnés dans les électrophéromies CE subséquents (voir ci-dessous). Notamment, comme le but de l'étape GE est purement pour la vérification qualitative des amplicons PCR, le temps de fonctionnement, la tension et / ou la recette de gel peut être ajusté comme préféré. Si des bandes particulièrement faibles sont observées par GE, il peut être conseillé de réduire le facteur de dilution de ces échantillons avant l'EC.
Bien que le protocole CE décrit ici ait été exécuté sur un appareil commercial spécifique d'électrophoresis capillaire (voir Tableau des matériaux),différents systèmes CE peuvent avoir des exigences d'échantillon différentes, ce qui peut à son tour entraîner quelques modifications au protocole . Consultez le manuel du fabricant respectif du système CE pour obtenir des instructions sur les réactifs/équipements appropriés, l'étalonnage, etc. pour l'analyse des fragments. Il est également possible que les modèles biaisés de mobilité des amplicons observés pendant le CE diffèrent, relativement, entre les systèmes CE et/ou les machines, comme cela a déjà été documenté pour d'autres protocoles MLVA15,16. Si les nombres de répétitions VNTR définitifs (arrondis) sont affectés, cela signifie que les variables spécifiques au locus s et i (tableau 1), utilisées pour déterminer les nombres de répétitions VNTR, doivent être recalibrées. Il s'agit d'une régression linéaire sur des parcelles comparant des séquences précises par rapport aux appels de taille CE, comme l'ont décrit Gulla et al., 201814.
Les pics fendus et les pics de bégaiement, deux artefacts bien connus dans la DLVA basée sur CE, tapent17, peuvent être observés dans les électrophéspics lors des appels de taille (Figure 4). Bien que les pics de bégaiement doivent être ignorés, le pic plus long doit être systématiquement sélectionné pour les applications en aval dans le cas de pics fractionnés séparés par une seule paire de base. En outre, les pics absents indiquant l'absence de loci VNTR particulier sont rares, mais peuvent se produire, auquel cas un nombre répété de «0» devrait être attribué. Si la culture de départ à partir de laquelle l'ADN est extrait n'est pas pure (c.-à-d., contient plus d'un sous-type Y. ruckeri), plusieurs pics de haut taille correspondant à différents allèles du même locus/loci peuvent être observés après CE. Les cultures secondaires doivent ensuite être effectuées à partir de colonies individuelles avant la nouvelle extraction d'ADN pour le re-typage.
Comme indiqué dans le protocole, l'ADN modèle pour PCR devrait par défaut être extrait des cultures pures de Y. ruckeri. Dans quelques cas, cependant, des échantillons de fluided-œufs testés positifs pour Y. ruckeri par qPCR (Ct-values 'lt; 27) ont été avec succès MLVA tapé directement, sans culture préalable, en utilisant une quantité accrue d'ADN génomique (extrait avec kit commercial) comme modèle. Bien que cette approche n'ait pas été largement testée ni vérifiée, elle indique le potentiel de cet essai MLVA pour l'examen de matrices biologiques complexes contenant de l'ADN provenant d'une gamme d'organismes différents en plus de Y. ruckeri.
L'ensemble de la procédure de dactylographie MLVA présentée ici, de l'extraction de l'ADN à l'évaluation épizootiologique, peut être complétée en une seule journée de travail. Cependant, le nombre d'échantillons examinés est dans une relation sublinéaire avec le temps requis pour l'extraction de l'ADN, PCR et CE, et la méthode est donc beaucoup plus efficace en temps d'exécution de plusieurs échantillons simultanément. C'est néanmoins le cas pour la plupart des méthodes en laboratoire, et comme un outil pour le sous-typage épidémiologique de Y. ruckeri, la combinaison de haute résolution, la simplicité et la portabilité rend cet analyse MLVA supérieure aux protocoles précédemment publiés4 ,5. Il a également été utilisé pour vérifier la pertinence épidémiologique limitée de Y. ruckeri serotyping14.
Grâce à une étude complète sur la population basée sur MLVA impliquant 484 isolats de Y. ruckeri récupérés à partir d'une gamme d'origines et d'habitats spatiotemporels (poissons hôtes, environnement, etc.), notre compréhension de l'épizootiologie et de la population structure de cet important agent pathogène du poisson a été considérablement augmenté14. La dactylographie MLVA a permis de retracer les clones disséminés anthropogéniquement au cours des décennies, vraisemblablement par le transport de poissons, ainsi que l'identification de souches confinées localement. De plus, alors que certains complexes clonaux de la bactérie pourraient clairement être associés à des maladies chez des hôtes de poissons particuliers (truite arc-en-ciel et saumon de l'Atlantique, respectivement), d'autres n'ont été récupérés que par des sources environnementales et/ou des poissons cliniquement non affectés. Spécimens. L'applicabilité de la méthode ne se limite donc pas seulement au traçage des infections, car elle peut également fournir des informations sur la pertinence potentielle, par exemple pour la mise au point de vaccins, l'évaluation des risques et le maintien de la biosécurité nationale. Il est actuellement utilisé activement à l'Institut vétérinaire norvégien comme un outil pour étudier les diagnostics de Y. ruckeri dans l'aquaculture norvégienne.
Disclosures
Les auteurs n'ont rien à révéler.
Acknowledgments
La présente étude a été financée par le Fonds norvégien de recherche sur les fruits de mer, FHF (projet s901119 et 901505). Nous tenons à remercier tous les contributeurs d'isolats bactériens et d'échantillons utilisés lors du développement de la méthode.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 22°C/15°C incubator | As preferred. | NA | |
| 5' Labeled Primer, 10K PMOL, Desalted, Dry | Thermo Fisher Scientific | 450007 | Sequences and labelling in Table 1. Prepare working aliquouts in TE-buffer. |
| Agarose, universal, peqGOLD | VWR | 732-2789P/732-2788 | Used during gel electrophoresis. |
| Avant 3500xL Genetic Analyzer | Thermo Fisher Scientific | A30469 | Used for capillary electrophoresis fragment analysis. |
| BioNumerics7 modules | Applied Maths | NA | Used for generating Minimum spanning trees from MLVA data. |
| Centrifuge(s) | As preferred. | NA | |
| Custom DNA Oligo, 25N, Desalted, Dry | Thermo Fisher Scientific | A15612 | Sequences in Table 1. Prepare working aliquouts in TE-buffer. |
| DNA Gel Loading Dye (6X) | Thermo Fisher Scientific | R0611 | Loading dye used during gel electrophoresis. |
| Eppendorf Safe-Lock Tubes, 1.5 mL | Eppendorf | 30120086 | Centrifuge tubes used during DNA extraction. |
| Freezer | As preferred. | NA | |
| Fume cupboard | As preferred. | NA | |
| Gel electrophoresis system | As preferred. | NA | |
| GelRed Nucleic Acid Stain, 10,000X in water | Biotium | 41003 | Fluorescent nucleic acid dye used during gel electrophoresis. |
| GeneMapper Software 5 | Thermo Fisher Scientific | 4475073 | Used for reading electropherograms from capillary electrophoresis. |
| GeneRuler 50 bp DNA Ladder, ready-to-use | Thermo Fisher Scientific | SM0373 | DNA ladder used during gel electrophoresis. |
| GeneScan 600 LIZ dye Size Standard v2.0 | Thermo Fisher Scientific | 4408399 | Size standard used during capillary electrophoresis. |
| Heating block | As preferred. | NA | |
| Hi-Di Formamide | Thermo Fisher Scientific | 4311320/4440753 | Deionized formamide used during capillary electrophoresis. Prepare working aliquouts. |
| Milli-Q water | NA | NA | Purified water used during PCR and capillary electrophoresis. Standard recipe; produced in-house. |
| Multiplex PCR Plus Kit | Qiagen | 206151/206152 | |
| PCR thermal cycler | As preferred. | NA | |
| POP-7 Polymer for 3500 Dx/3500xL Dx Genetic Analyzers | Thermo Fisher Scientific | A26077/4393713/4393709 | Separation matrix used during capillary electrophoresis. |
| Pure culture Yersinia ruckeri | NA | NA | E.g. cryopreserved or fresh. |
| RNase-free water | Qiagen | NA | In: Multiplex PCR Plus Kit |
| Tris-borate-EDTA (TBE) buffer | NA | NA | Standard recipe; produced in-house. |
| Trypsine soy agar/bovine blood agar | NA | NA | Standard recipe; produced in-house. |
| UV-based gel imaging/visualisation system | As preferred. | NA | |
| Vortexer | As preferred. | NA |
References
- Barnes, A. C. Enteric redmouth disease (ERM) (Yersinia ruckeri). Fish Diseases and Disorders, Vol 3: Viral, Bacterial and Fungal Infections. 3, 484-511 (2011).
- Barnes, A. C., et al. Whole genome analysis of Yersinia ruckeri isolated over 27 years in Australia and New Zealand reveals geographical endemism over multiple lineages and recent evolution under host selection. Microbial Genomics. 2 (11), 000095 (2016).
- Calvez, S., Mangion, C., Douet, D. G., Daniel, P. Pulsed-field gel electrophoresis and multi locus sequence typing for characterizing genotype variability of Yersinia ruckeri isolated from farmed fish in France. Veterinary Research. 46, 73 (2015).
- Bastardo, A., Ravelo, C., Romalde, J. L. Multilocus sequence typing reveals high genetic diversity and epidemic population structure for the fish pathogen Yersinia ruckeri. Environmental Microbiology. 14 (8), 1888-1897 (2012).
- Wheeler, R. W., et al. Yersinia ruckeri biotype 2 isolates from mainland Europe and the UK likely represent different clonal groups. Diseases of Aquatic Organisms. 84 (1), 25-33 (2009).
- Eyre, D. W., et al. Comparison of multilocus variable-number tandem-repeat analysis and whole-genome sequencing for investigation of Clostridium difficile transmission. Journal of Clinical Microbiology. 51 (12), 4141-4149 (2013).
- Sun, M., et al. Multiple Locus Variable-Number Tandem-Repeat and Single-Nucleotide Polymorphism-Based Brucella Typing Reveals Multiple Lineages in Brucella melitensis Currently Endemic in China. Frontiers in Veterinary Science. 4, (2017).
- Bouchouicha, R., et al. Comparison of the performances of MLVA vs. the main other typing techniques for Bartonella henselae. Clinical Microbiology and Infection. 15, SUPPL 2 104-105 (2009).
- Dahyot, S., et al. Multiple-Locus Variable Number Tandem Repeat Analysis (MLVA) and Tandem Repeat Sequence Typing (TRST), helpful tools for subtyping Staphylococcus lugdunensis. Scientific Reports. 8 (1), (2018).
- Elberse, K. E. M., Nunes, S., Sá-Leão, R., van der Heide, H. G. J., Schouls, L. M. Multiple-locus variable number tandem repeat analysis for Streptococcus pneumoniae: Comparison with PFGE and MLST. PLoS ONE. 6 (5), (2011).
- Matejusova, I., et al. Multilocus variable-number tandem-repeat genotyping of Renibacterium salmoninarum, a bacterium causing bacterial kidney disease in salmonid fish. BMC microbiology. 13, 285 (2013).
- Duodu, S., et al. An improved multiple-locus variable-number of tandem repeat analysis (MLVA) for the fish pathogen Francisella noatunensis using capillary electrophoresis. BMC Veterinary Research. 9, 252 (2013).
- Abayneh, T., Colquhoun, D. J., Austin, D., Sørum, H. Multilocus variable number tandem repeat analysis of Edwardsiella piscicida isolates pathogenic to fish. Journal of Fish Diseases. 37 (11), 941-948 (2014).
- Gulla, S., et al. Multilocus variable-number tandem-repeat analysis of Yersinia ruckeri confirms the existence of host specificity, geographic endemism, and anthropogenic dissemination of virulent clones. Applied and Environmental Microbiology. 84 (16), (2018).
- Pasqualotto, A. C., Denning, D. W., Anderson, M. J. A cautionary tale: Lack of consistency in allele sizes between two laboratories for a published multilocus microsatellite typing system. Journal of Clinical Microbiology. 45 (2), 522-528 (2007).
- Lista, F., et al. Genotyping of Bacillus anthracis strains based on automated capillary 25-loci multiple locus variable-number tandem repeats analysis. BMC Microbiology. 6, 33 (2006).
- Thermo Fisher Scientific DNA Fragment Analysis by Capillary Electrophoresis. , Available from: https://www.thermofisher.com/content/dam/LifeTech/global/Forms/PDF/fragment-analysis-chemistry-guide.pdf (2014).
