Kombinatorik miRNA düzenleyen hücre döngüsü ve anjiogenezi tedavilere analizi
Summary
miRNA tedavi kanser ilerleme düzenlenmesinde önemli potansiyele sahip. Aşağıda gösterildiği analitik yaklaşımlar hücre döngüsü ve anjiogenezi durdurma içinde bir birleşimsel miRNA tedavi faaliyetinin tanımlaması için kullanılır.
Abstract
Akciğer kanseri (LC) kanser bağlı ölüm dünya çapında önde gelen nedenidir. Diğer kanser hücrelerinin, LC hücreleri temel karakteristik düzensiz yayılması ve hücre bölünmesi benzer. Hücre döngüsü ilerleme durdurma tarafından yayılması inhibisyonu LC dahil olmak üzere kanser tedavisi için umut verici bir yaklaşım gibi gösterilmiştir.
miRNA therapeutics önemli çoğu gen düzenleyiciler ortaya çıkan ve giderek kanser tedavisinde kullanılmak incelendiği. Son çalışmada, iki miRNAs, miR-143 ve miR-506, hücre döngüsü ilerleme düzenlemek için kullanılan. A549 küçük hücreli dışı akciğer kanseri (NSCLC) hücreleri transfected, gen ifade değişikliklerini analiz edildi ve apoptotik etkinliği nedeniyle tedavi sonunda analiz edildi. Siklin bağımlı kinazlar (CDKs) downregülasyon algılandı (yani, CDK1, CDK4 ve CDK6), ve hücre döngüsü G1/S ve G2/M faz geçişleri durdurdu. Yolu analiz yaklaşım çok yönlü aktivitesiyle endows tedavinin potansiyel anjiogenik faaliyet göstermiştir. Burada açıklanan angiogenez inhibisyonu tarafından miRNA aktiviteyle ilgili hücre döngüsü inhibisyon, Apoptozis indüksiyon ve endotel hücreleri tedavisinin etkileri tanımlamak için kullanılan yöntemleri vardır. Burada sunulan yöntemleri gelecekteki araştırma miRNA therapeutics ve karşılık gelen etkinliğini destekleyecek ve temsilcisi veri deneysel analizleri sırasında diğer araştırmacılar rehberlik edecek umulmaktadır.
Introduction
Hücre döngüsü DNA ve Hücre proliferasyonu ile Mitotik süreci1tekrarını izin birden çok düzenleyici olayların bir kombinasyonudur. Siklin bağımlı kinazlar (CDKs) düzenleyen ve hücre döngüsü2teşvik. Bunlar arasında Mitotik CDK (CDK1) ve Interphase CDKs (CDK2, CDK4 ve CDK6) hücre döngüsü ilerleme3‘ te bir rol var. Retinoblastom protein (Rb) CDK4/hücre döngüsü ilerleme4izin vermek için CDK6 tarafından karmaşık fosforile ve CDK1 etkinleştirme başarılı hücre bölünmesi5için esastır. Çok sayıda CDK inhibitörleri geliştirilen ve CDKs kanser tedavisinde hedefleme potansiyeli gösteren son birkaç on yıl içinde klinik deneylere değerlendirildi. Aslında, üç CDK inhibitörleri meme kanseri tedavisi için onaylanmış olan son zamanlarda6,7,8,9,10. Böylece, CDKs, ve özellikle, CDK1 ve CDK4/6, kanser hücre ilerleme düzenlenmesinde büyük ilgi.
miRNAs (miRs) küçük, kodlamayan RNA’ların ve tüm insan genlerinin11yaklaşık % 30’u düzenleyen gen ifadesinin çoğu düzenleyiciler vardır. Faaliyetlerini translasyonel baskı ya da haberci RNA (mRNA)12bozulma dayanır. Onların biyolojik önemi açıklayıcı, 5.000’den fazla miRNAs tespit edilmiştir ve bir tek miRNA molekül birden çok gen11,13düzenleyen. Daha da önemlisi, miRNA ifade hastalık durumları, kanser13de dahil olmak üzere ve farklı hastalıklar ile ilişkili olduğu düşünülmektedir. Aslında, miRNAs kadar oncogenic ile karakterize veya tümör bastırıcılarının, teşvik veya tümör gelişme ve ilerleme14,15bastırmak için yetenekli olmak. MiRNAs hastalıklı dokuları içinde göreli ifade hastalık ilerleme düzenleyen; Böylece, miRNAs eksojen teslimini terapötik bir potansiyele sahiptir.
Akciğer kanseri olduğu önde gelen neden kanser ile ilgili ölümlerin ve daha büyük daha tüm akciğer maligniteler % 60’ı küçük hücre akciğer kanserleri16,17, 5 yıllık sağkalım oranı az % 20 ile18. MiR-143-3 p ve miR-506-3 p kullanımı son zamanlarda akciğer kanseri hücreleri11hücre döngülerle hedefleme için değerlendirilmiştir. miR-143 ve miR-506 tamamlayıcılık CDK1 ve CDK4/CDK6 dizileri ve A549 hücreleri bu iki miRs etkilerini analiz edildi. Deneysel detayları sundu ve bu yazıda ele. Gen ifadesinin, hücre döngüsü ilerleme ve Apoptozis farklı deneysel tasarım ve transfection takip timepoints kullanarak değerlendirildi. Biz gerçek zamanlı kantitatif PCR (RT-qPCR) yöntemleri ile birlikte Mikroarray analiz belirli bir gen ifade ölçmek için kullanılan ve yeni nesil RNA sıralama küresel gen bozukluk11belirlemek için kullanılmıştır. Genler binlerce tek bir deneysel analizi analiz edilebilir iken ikinci yöntemi ile yüksek hassasiyet ve tekrarlanabilirlik, her genin transkript göreli bolluk tanımlar. Ayrıca, apoptotik analiz miRNA tedavi nedeniyle yapıldı ve burada anlatılan. Biyoinformatik yolu analiz desteklenmiştir. Burada sunulan iletişim kuralları analiz tedavi için Kombinatorik miR-143, potansiyel ve miR-506 kullanılır.
Ana amacı bu iletişim kuralı, miRNAs hücrelerde, hücre döngüsü odaklanarak etkilerini belirlemektir. Çeşitli teknikler burada yayılma alanından gen ifade analizi öncesi çeviri (ayrıntı için qPCR kullanarak) ve yeni sunulan teknikleri gen Analizi Mikroarray çözümlemesi gibi protein düzeyinde için. Bu rapor araştırmacılar miRNAs ile çalışmak için yararlıdır umulmaktadır. Ayrıca, metodoloji Apoptozis hücre ve hücre döngüsünün akış sitometrik analizi için sunulmaktadır.
Protocol
Representative Results
Discussion
miRNAs kanser tedavisi, ifade seviyelerinde bozukluk tanıma için hedeflenmiş tedaviler olarak çalışabilir hastalıklı normal dokuların vs. Bu çalışmada potansiyel olarak birden çok aşamaları sırasında hücre döngüsü ilerleme durdurmak miRNAs belirlemek amaçlanmıştır. MiR-143 ve miR-506 hücre döngüsü bu Kombinatorik miRNA tedavinin etkinliğini anlamayı amaçlayan sunulan iletişim kuralları ve kanser hücrelerinin durdurmak tespit edilmiştir.
Açıklanan yöntemle…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Hiçbir çıkar çatışmaları bildirilir.
Materials
| -80 °C Freezer | VWR | VWR40086A | |
| 96 well plate | CELLTREAT Scientific | 50-607-511 | |
| 96-well Microwell Plates | Thermo Scientific | 12-556-008 | |
| A549 Non Small Cell Lung Cancer Cells | ATCC | ATCC CCL-185 | |
| Agarose | VWR | 0710-25G | |
| Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2938c | |
| Ambion Silencer Negative Control No. 1 siRNA | Ambion | AM4611 | |
| Antibiotic-Antimycotic Solution (100x) | Gibco | 15240-062 | |
| Antibody Array Assay Kit, 2 Reactions | Full Moon Bio | KAS02 | |
| Bright field microscope | Microscoptics | IV-900 | |
| Bright field microscope | New Star Environment LLC | ||
| Cell Cycle Antibody Array, 2 Slides | Full Moon Bio | ACC058 | |
| Cell Logic+ Biosafety Cabinate | Labconco | 342391100 | |
| Cellquest Pro | BD bioscience | Steps 5.14; 6.13: Used for calculating the population distrubution according to the cell cycle phase and for calculating the population distribution for the analysis of apoptosis | |
| CFX96 Real Time System | BioRad | CFX96 Optics Module | |
| Chemidoc Touch Imaging System | BioRad | Chemidoc Touch Imaging System | |
| CO2 Incubator | Thermo Scientific | HERAcell 150i | |
| Cultrex Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix | Trevigen | 3433-010-01 | |
| Digital Camera | AmScope | FMA050 | |
| DMEM 4.5 g/L Glucose, w/out Sodium Pyruvate, w/ L-Glutamine | VWR | VWRL0100-0500 | |
| DNAse I | Zymo Research | E1010 | |
| Endothelial Cell Growth Supplement (ECGS) | BD Biosciences | 356006 | |
| Eppendorf Pipette Pick-A-Pack Sets | Eppendrof | 05-403-152 | |
| Ethanol, Absolute (200 Proof), Molecular Biology Grade, | Fisher BioReagents | BP2818500 | |
| Ethidium bromide | Alfa acar | L07462 | |
| F-12K Nutrient Mixture (Kaighn's Mod.) with L-glutamine, Corning | Corning | 45000-354 | |
| FACS Calibur Flowcytometer | Becton Dickinson | ||
| Fetal Bovine Serum – Premium | Antlanta Biologicals | S11150 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Fisher Scientific | 10438026 | |
| Fisherbrand Basix Microcentrifuge Tubes with Standard Snap Caps | Fisherbrand Basix | 02-682-002 | |
| Forma Series II water Jacket CO2 incubator | Thermo Scientific | ||
| Heparin Solution (5000 U/mL) | Hospira | NDC#63739-920-11 | |
| Horixontal Electrophoresis system | Benchtop lab system | BT102 | |
| hsa-miR-143-3p miRNA Mimic | ABM | MCH01315 | |
| hsa-miR-506-3p miRNA Mimic | ABM | MCH02824 | |
| Human Recombinant Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) | Thermo Scientific | PHC9394 | |
| Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC) | Individual donors | IRB# A15-3891 | |
| HyClone Phosphate Buffered Saline (PBS) | Fisher Scientific | SH30256FS | |
| Ingenuity Pathway Analysis | Qiagen | Results: Used for bioinformatics pathway analysis | |
| Invitrogen UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water | Invitrogen | 10-977-015 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11-668-027 | |
| Loading dye 10X | ward's science+ | 470024-814 | |
| Medium M199 (with Earle′s salts, L-glutamine and sodium bicarbonate) | Sigma Aldrich | M4530 | |
| Microscope Digital Camera | AmScope | MU130 | |
| Modfit LT | Verity Software | Step 5.15: Alternative software for analysis of cell cycle population distributions | |
| Nanodrop | Thermo Scientific | NanoDrop one C | |
| Opti-MEM | Gibco by life technologies | 31985-070 | |
| Penicillin-streptomycin 10/10 | Antlanta Biologicals | B21210 | |
| Power UP sybr green master mix | Applied Biosystems | A25780 | |
| Propidium Iodide | MP Biochemicals LLC | IC19545825 | |
| Proscanarray HT Microarray scanner | Perkin elmer | ASCNPHRG. We used excitation laser wavelength at 543 nm. | |
| q PCR optical adhesive cover | Applied Biosystems | 4360954 | |
| Quick-RNA Kits | Zymo Research | R1055 | |
| Ribonuclease A from Bovine pancreas | Sigma | R6513-50MG | |
| ScanArray Express | PerkinElmer | Step 7.33: Microarray analysis software | |
| Shaker | Thermo Scientific | 2314 | |
| SimpliAmp Thermal Cycler | Applied Biosystems | ||
| SpectraTube Centrifuge Tubes 15ml | VWR | 470224-998 | |
| SpectraTube Centrifuge Tubes 50ml | VWR | 470225-004 | |
| TBS Buffer, 20x liquid | VWR | 10791-796 | |
| Temperature controlled centrifuge matchine | Thermo Scientific | ST16R | |
| Temperature controlled micro centrifuge matchine | Eppendrof | 5415R | |
| Thermo Scientific BioLite Cell Culture Treated Flasks | Thermo Scientific | 12-556-009 | |
| Thermo Scientific Pierce BCA Protein Assay | Thermo Scientific | PI23225 | |
| Thermo Scientific Pierce RIPA Buffer | Thermo Scientific | PI89900 | |
| Thermo Scientific Thermo-Fast 96-Well Full-Skirted Plates | Thermo Scientific | AB0800WL | |
| Thermo Scientific Verso cDNA synthesis Kit (100 runs) | Thermo Scientific | AB1453B | |
| Ultra Low Range DNA Ladder | Invitrogen | 10597012 | |
| VWR standard solid door laboratory refrigerator | VWR |
References
- Schafer, K. A. The cell cycle: a review. Veternary Pathology. 35 (6), 461-478 (1998).
- Barnum, K. J., O’Connell, M. J. Cell cycle regulation by checkpoints. Methods in Molecular Biology. 1170, 29-40 (2014).
- Malumbres, M., Barbacid, M. Cell cycle, CDKs and cancer: a changing paradigm. Nature Reviews Cancer. 9 (3), 153-166 (2009).
- Chen, Z., et al. Multiple CDK inhibitor dinaciclib suppresses neuroblastoma growth via inhibiting CDK2 and CDK9 activity. Science Repository. 6, 29090 (2016).
- Brown, N. R., et al. CDK1 structures reveal conserved and unique features of the essential cell cycle CDK. Nature Communications. 6, 6769 (2015).
- Sanchez-Martinez, C., Gelbert, L. M., Lallena, M. J., de Dios, A. Cyclin dependent kinase (CDK) inhibitors as anticancer drugs. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 25 (17), 3420-3435 (2015).
- Shah, A., et al. FDA Approval: Ribociclib for the Treatment of Postmenopausal Women with Hormone Receptor-Positive, HER2-Negative Advanced or Metastatic Breast Cancer. Clinical Cancer Research. , (2018).
- Asghar, U., Witkiewicz, A. K., Turner, N. C., Knudsen, E. S. The history and future of targeting cyclin-dependent kinases in cancer therapy. Nature Reviews Drug Discovery. 14 (2), 130-146 (2015).
- Mullard, A. FDA approves Novartis’s CDK4/6 inhibitor. Nature Reviews Drug Discovery. 16 (4), 229 (2017).
- Walker, A. J., et al. FDA Approval of Palbociclib in Combination with Fulvestrant for the Treatment of Hormone Receptor-Positive, HER2-Negative Metastatic Breast Cancer. Clinical Cancer Research. 22 (20), 4968-4972 (2016).
- Hossian, A., Sajib, M. S., Tullar, P. E., Mikelis, C. M., Mattheolabakis, G. Multipronged activity of combinatorial miR-143 and miR-506 inhibits Lung Cancer cell cycle progression and angiogenesis in vitro. Science Repository. 8 (1), 10495 (2018).
- Inamura, K., Ishikawa, Y. MicroRNA In Lung Cancer: Novel Biomarkers and Potential Tools for Treatment. Journal of Clinical Medicine. 5 (3), (2016).
- Mizuno, K., et al. The microRNA expression signature of small cell lung cancer: tumor suppressors of miR-27a-5p and miR-34b-3p and their targeted oncogenes. Journal of Human Genetics. 62 (7), 671-678 (2017).
- Zhang, B., Pan, X., Cobb, G. P., Anderson, T. A. microRNAs as oncogenes and tumor suppressors. Developmental Biology. 302 (1), 1-12 (2007).
- Peng, Y., Croce, C. M. The role of MicroRNAs in human cancer. Signal Transduction and Targeted Therapy. 1, 15004 (2016).
- Wang, X., et al. Prediction of recurrence in early stage non-small cell lung cancer using computer extracted nuclear features from digital H&E images. Science Repository. 7 (1), 13543 (2017).
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. . Cancer Statistics, 2017. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 67 (1), 7-30 (2017).
- Saxon, J. A., et al. p52 expression enhances lung cancer progression. Science Repository. 8 (1), 6078 (2018).
- Carpentier, G. Angiogenesis Analyzer for ImageJ. ImageJ User and Developer Conference. , (2012).
- Robinson, M. D., McCarthy, D. J., Smyth, G. K. edgeR: a Bioconductor package for differential expression analysis of digital gene expression data. Bioinformatics. 26 (1), 139-140 (2010).
- Robinson, M. D., Oshlack, A. A scaling normalization method for differential expression analysis of RNA-seq data. Genome Biology. 11 (3), R25 (2010).
- DeCicco-Skinner, K. L., et al. Endothelial cell tube formation assay for the in vitro study of angiogenesis. Journal of Visualized Experiments. (91), e51312 (2014).
- Kong, D. H., Kim, M. R., Jang, J. H., Na, H. J., Lee, S. A Review of Anti-Angiogenic Targets for Monoclonal Antibody Cancer Therapy. International Journal of Molecular Science. 18 (8), (2017).
- Wong, P. P., Bodrug, N., Hodivala-Dilke, K. M. Exploring Novel Methods for Modulating Tumor Blood Vessels in Cancer Treatment. Current Biology. 26 (21), R1161-R1166 (2016).
- Evan, G. I., Brown, L., Whyte, M., Harrington, E. Apoptosis and the cell cycle. Current Opinion in Cell Biology. 7 (6), 825-834 (1995).
- Haab, B. B., Dunham, M. J., Brown, P. O. Protein microarrays for highly parallel detection and quantitation of specific proteins and antibodies in complex solutions. Genome Biology. 2 (2), RESEARCH0004 (2001).
- Sutandy, F. X., Qian, J., Chen, C. S., Zhu, H. Overview of protein microarrays. Currrent Protocols in Protein Science. 27, 21 (2013).
- St-Pierre, C., et al. Transcriptome sequencing of neonatal thymic epithelial cells. Science Repository. 3, 1860 (2013).
