Valutazione di molteplicità sinaptica utilizzando cellule intere Patch-clamp Elettrofisiologia
Summary
Qui, presentiamo un protocollo per la valutazione funzionale molteplicità sinaptica utilizzando cellule intere patch ed elettrofisiologia di morsetto in fettine di cervello acuto.
Abstract
Nel sistema nervoso centrale, un paio di neuroni formano spesso più contatti sinaptici e/o siti di rilascio di neurotrasmettitore funzionale (molteplicità sinaptica). Molteplicità di sinaptica è di plastica e cambiamenti nel corso dello sviluppo e in differenti condizioni fisiologiche, essendo un fattore determinante per l’efficacia della trasmissione sinaptica. Qui, descriviamo gli esperimenti per stimare il grado di molteplicità di sinapsi che chiude su un dato neurone postsinaptico usando cellule intere patch ed elettrofisiologia di morsetto in fettine di cervello acuto. In particolare, registrazione di tensione-morsetto viene utilizzato per confrontare la differenza tra l’ampiezza delle correnti postsinaptiche eccitatori spontanee (sEPSC) e in miniatura eccitatori postsinaptici correnti (mIPSCs). La teoria dietro questo metodo è che input afferente che esibiscono molteplicità mostrerà sEPSC grande, potenziale d’azione-dipendente a causa del rilascio sincrono che si verifica a ogni contatto sinaptico. Al contrario, rilascio potenziale di azione indipendente (che è asincrona) genererà più piccola ampiezza mIPSCs. Questo articolo definisce una serie di esperimenti e analisi per caratterizzare l’esistenza di molteplicità sinaptica e vengono illustrati i requisiti e le limitazioni della tecnica. Questa tecnica può essere applicata per studiare come i diversi interventi comportamentali, farmacologici o ambientali in vivo influenzano l’organizzazione dei contatti sinaptici in aree differenti del cervello.
Introduction
Trasmissione sinaptica è un meccanismo fondamentale per la comunicazione tra neuroni e quindi, funzione cerebrale. Trasmissione sinaptica anche è labile e può cambiare la sua efficacia in maniera dipendente di attività anche come in risposta a segnali modulatoria1. Così, esaminando funzione sinaptica è stato dei principali obiettivi di ricerca in neuroscienza. Elettrofisiologia di cellule intere patch clamp è una tecnica versatile che permette di comprendere, di elaborare disegni sperimentali e analisi dei dati, approfondite meccanismi biofisici e molecolari della trasmissione sinaptica. Un approccio comunemente utilizzato, forse a causa della semplicità del concetto e tecnica, è la misura delle correnti postsinaptico eccitatorio/inibitorio in miniatura (mE / IPSCs) nell’ambito della tensione morsetto configurazione2,3, 4 , 5 , 6. mPSCs individuali rappresentano il flusso di ioni attraverso recettori ionotropici postsinaptici (ad es. recettori AMPA e GABAA ) in risposta all’associazione dei loro rispettivi neurotrasmettitori rilasciati dal terminale presinaptico 7 . Perché la registrazione si ottiene in presenza della tensione-gated Na+ canale bloccanti della tetrodotossina (TTX), l’uscita è indipendente dal potenziale d’azione e prevede normalmente una singolo delle vescicole sinaptiche che contiene del neurotrasmettitore. Basato su questo presupposto, l’ampiezza media di mPSCs è ampiamente usato come una stima grezza per la dimensione quantal, che rappresenta il numero e la funzionalità dei recettori postsinaptici opposte di un singolo sito. D’altra parte, la frequenza di mPSCs è considerata di rappresentare una combinazione del numero totale delle sinapsi che chiude sulla cellula postsinaptica e loro probabilità di rilascio medio. Tuttavia, questi parametri non misurare un’altra variabile-multiplicativity di sinapsi, o molteplicità sinaptica — che è importante per l’efficacia della trasmissione sinaptica.
Basato sulla teoria quantal della trasmissione sinaptica7,8,9, la forza di una determinata connessione tra una coppia di neuroni è dipendente da tre fattori: il numero delle sinapsi funzionali (N), il risposta postsinaptica al rilascio di una singola vescicola sinaptica (quantal dimensione; Q) e la probabilità di rilascio di neurotrasmettitore (Pr). Sinaptica molteplicità equivale a N. Lo sviluppo di molteplicità sinaptica o la potatura delle sinapsi moltiplicative è plastica nel corso dello sviluppo e nella malattia diversi stati3,4,6,10. Per questo motivo, che caratterizzano la molteplicità sinaptica ha implicazioni importanti per comprendere l’efficacia della trasmissione sinaptica nella salute e nella malattia. Tecniche, come il microscopio elettronico possono identificare prove strutturali di molteplicità sinaptica rilevando più contatti sinaptici provenienti dall’assone stesso sulla stesso neurone postsinaptico11,12, 13,14. Tuttavia, questi multisynapses strutturalmente identificati possono essere funzionalmente silenzioso15,16. Esame preciso funzionale di N richiede tecnicamente impegnativi approcci elettrofisiologici, come accoppiati registrazioni della intero-cellula che possono identificare se una determinata connessione dispone di più siti di rilascio funzionale e minimale approcci di stimolazione che mirano a reclutare un singolo assone putativo.
In questo protocollo, descriviamo un metodo semplice per stimare la molteplicità sinaptica adottando un metodo sviluppato originariamente da Hsia et al2. Questa tecnica prevede la misura di spontanea PSC (sPSCs) e mPSCs usando cellule intere patch clamp ed elettrofisiologia, che ci permette di stimare il grado di molteplicità sinaptica attraverso tutti gli ingressi ad un dato neurone. Come definito in precedenza, sinaptica molteplicità riflette il numero di sinapsi tra un dato neurone pre- e postsinaptico. Se più sinapsi sono reclutate in sincronia di un potenziale di azione, ci sarà un’alta probabilità di temporale sommatoria di singoli sportelli unici (cioè quantali), generando una maggior ampiezza PSC. Nelle registrazioni mPSC (in cui i potenziali di azione sono bloccati da TTX), la probabilità di temporale sommatoria di singoli mPSCs (asincrono) è bassa. Utilizzando questa logica, molteplicità sinaptica può essere stimata confrontando l’ampiezza sPSC (con rilascio di potenziale di azione-dipendente) per l’ampiezza di mPSC.
Per esaminare l’esistenza di molteplicità Descriviamo quattro esperimenti e loro analisi utilizzando glutamatergic EPSC come esempio. Tuttavia, lo stesso approccio può essere utilizzato per la veloce trasmissione GABAergica/glycinergic (IPSCs). Una breve spiegazione razionale per ogni esperimento è descritto di seguito. In primo luogo, come spiegato sopra, molteplicità sinaptica può essere stimata confrontando l’ampiezza del sEPSC a mIPSCs. Ci sono due requisiti per questo approccio; 1) presinaptici assoni devono sparare un numero sufficiente di potenziali d’azione durante la registrazione, e 2) Pr deve essere alta in modo che le sinapsi più rilasciare neurotrasmettitore dopo l’arrivo del potenziale d’azione. Per soddisfare questi requisiti, sEPSC sono per la prima volta in basso Ca2 + artificiale del liquido cerebrospinale (aCSF) e poi registrato in presenza di una bassa concentrazione dell’antagonista canale K+ , 4-aminopiridina (4-AP) per aumentare l’azione infornamento potenziale e Pr. Quindi di infornamento del potenziale di azione è bloccato da TTX e Pr sono diminuite di una tensione-gated Ca2 + antagonista Cd2 +. L’ampiezza del sEPSC (con 4AP) è paragonato a quello di mEPSC (con 4AP, TTX e Cd2 +). Nel secondo esperimento, Ca2 + è sostituito da equimolare Sr2 + in aCSF a desincronizzarsi rilascio vescicola. Come Ca2 + è necessario per il rilascio sincrono delle vescicole, sostituzione con Sr2 + dovrebbe eliminare il sEPSC di grande ampiezza che sono indicativi di molteplicità. In terzo luogo, meccanicistico, molteplicità può derivare da entrambi più contatti sinaptici alla stesso neurone postsinaptico o multivesicular rilascio (cioè più vescicole rilasciate all’interno di un singolo contatto sinaptico)17,18. Per differenziare tra i due tipi di molteplicità, il terzo esperimento utilizza una bassa affinità, veloce dissociazione antagonista competitivo dei recettori AMPA, γ-D-glutamylglycine (γ-DGG)17,18 per determinare se grande sEPSC sono il risultato della somma temporale di sinapsi indipendente o multivesicular rilascio che agisce su una popolazione di sovrapposizione dei recettori postsinaptici. Se gli eventi di grande ampiezza derivano dalla release multivesicular, γ-DGG sarà meno efficace ad inibire più grande sEPSC rispetto ai più piccoli, mentre grandi sEPSC che derivano dalla sommatoria temporale dei contatti sinaptici multipli allo stesso modo saranno interessati da Γ-DGG. Nel quarto esperimento, un metodo più fisiologico viene utilizzato per migliorare il potenziale di azione sparando, vale a dire afferente stimolazione sinaptica. Scoppi di attività sinaptica possono transitoriamente aumento/facilitare la probabilità di infornamento e rilascio di potenziale di azione spontanea delle afferenze stimolata. Questo approccio permette quindi di molteplicità di manifestare in maniera più fisiologica.
Il seguente protocollo descrive il metodo per lo svolgimento di questi esperimenti nel tessuto ipotalamico del mouse. In particolare, corticotropina liberantesi ormone (CRH) neuroni del nucleo paraventricolare dell’ipotalamo (PVN) sono utilizzati. Descriviamo le procedure per lo svolgimento di elettrofisiologia di cellule intere patch clamp e spiegare gli esperimenti specifici per testare per molteplicità sinaptica.
Protocol
Representative Results
Discussion
Un importante requisito per un esperimento di successo patch clamp Elettrofisiologia è ottenere fette/cellule sane. Il nostro protocollo descritto è ottimizzato per fette ipotalamici che contengono neuroni PVN. Altre aree potrebbero richiedere di cervello per volta soluzioni e affettare metodi21,22,23,24. Per la registrazione, è fondamentale per accettare solo registrazioni stabile monitoran…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
J.S. ricevuto Ontario Graduate Scholarship. W.I. ha ricevuto un nuovo investigatore Fellowship dal Canada di ricerca sulla salute mentale. Questo lavoro è supportato da sovvenzioni di funzionamento a w. i da scienze naturali e ingegneria Research Council of Canada (06106-2015 RGPIN) e il Canadian Institute for Health Research (PJT 148707).
Materials
| 1 ml syringe | BD | 309659 | |
| 10 blade | Fisher Scientific/others | 35698 | |
| 22 blade | VWR/others | 21909-626 | |
| 22 uM syringe filters | Milipore | 09-719-000 | |
| Adson foreceps | Harvard Instruments | 72-8547 | |
| Angled sharp scissors | Harvard Instruments | 72-8437 | |
| Clampex | Molecular Devices | pClamp 10 | |
| Double edge blade | VWR | 74-0002 | |
| Filter paper | Sigma/others | 1001090 | |
| Fine paintbrush | Fisher/various | 15-183-35/various | |
| Gas Dispersion Tube | VWR | LG-8680-120 | |
| Isoflurane | Fresenius Kabi/others | M60303 | |
| Krazy glue | various | various | |
| Mini analysis | Synaptosoft | MiniAnalysis 6 | |
| Osmomoter | Wescor Inc | Model 5600 | |
| Parafilm | Sigma | PM-996 | |
| Pasteur pipette | VWR | 14672-200 | |
| ph meter | Mettler Toledo | FE20-ATC | |
| Rubber bulb | VWR | 82024-550 | |
| Scalpel handle No. 3 | Harvard Instruments | 72-8350 | |
| Scalpel handle No. 4 | Harvard Instruments | 72-8356 | |
| Single edge blade | VWR | 55411-050 | |
| Vibratome slicer | Leica | VT1200S | |
| Water Purification System | Millipore | Milli-Q Academic A10 | |
| Well plate lid | Fisher/various | 07-201-590/various | |
| Chemicals/reagents | |||
| 4-AP | Sigma | 275875 | |
| BAPTA | molecular probes | B1204 | |
| CaCl2*2H2O | Sigma | C7902 | |
| CdCl2 | sigma | 202908 | |
| DNQX | Tocris | 189 | |
| EGTA | Sigma | E3889 | |
| glucose | Sigma | G5767 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| K2-ATP | Sigma | A8937 | |
| KCl | Sigma | P9333 | |
| K-gluconate | Sigma | G4500 | |
| MgCl2*6H2O | Sigma | M2670 | |
| Molecular biology grade water | Sigma | W4502-1L | |
| Na3GTP | Sigma | G8877 | |
| NaCl | Bioshop | SOD001.1 | |
| Na-gluconate | Sigma | S2054 | |
| NaH2PO4 | Sigma | 71504 | |
| NaHCO3 | Sigma | S6014 | |
| Picrotoxin | sigma | P1675 | |
| SrCl | Sigma | 255521 | |
| sucrose | Bioshop | SUC507.1 | |
| TTX | Alamone Labs | T-550 | |
| yDGG | Tocris | 6729-55-1 |
References
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