En konvergerende strategi for generering af et næsten Sekvenserede cDNA-bibliotek fra ikke-refererede stillehavsøsters
Summary
Vi beskriver en strategi for, hvordan man bruger RNA-prøver fra ikke-refererede stillehavsøsters prøver, og evaluerer det genetiske materiale i forhold til offentligt tilgængelige genomdata for at generere et næsten sekvenserede cDNA-bibliotek.
Abstract
Adgang til biologisk materiale af reference arter, som tidligere blev anvendt i vigtige eksperimenter, såsom udvikling af nye cellelinjer eller genomsekvensering af projekter, er ofte vanskelige at give for yderligere undersøgelser eller tredjeparter på grund af af prøvernes forbruger karakter. Selv om de nu er bredt fordelt over Stillehavs kysterne i Asien, Australien og Nordamerika, er individuelle stillehavsøsters prøver genetisk meget forskellige og er derfor ikke direkte egnede som udgangsmateriale til genbiblioteker. I denne artikel viser vi brugen af ikke-refererede stillehavsøsters prøver opnået fra regionale fiskemarkeder for at generere cDNA-biblioteker. Disse biblioteker blev derefter sammenlignet med det offentligt tilgængelige østers genom, og det nærmeste relaterede bibliotek blev valgt ved hjælp af mitokondrie reference gener cytochrom C oxidase underenhed I (COX1) og NADH dehydrogenase (ND). Egnetheden af det genererede cDNA-bibliotek er også demonstreret ved kloning og ekspression af to gener, der koder enzymerne UDP-glucuronsyre dehydrogenase (UGD) og UDP-xylose syntase (UXS), som er ansvarlige for biosyntesen af UDP-xylose fra UDP-glucose.
Introduction
Erhvervelse af levende refereret biologisk materiale kan være udfordrende på grund af lange leveringstider, iværksætter tænkning eller landespecifikke toldbestemmelser. Alternativt kan det påkrævede biologiske materiale også indsamles fra fænotypiske identiske prøver. Disse prøver kan dog variere betydeligt med hensyn til genotype, og derfor bliver sammenligninger med digitalt lagrede reference genomer af samme art ofte vanskelige eller endda forgæves på grund af uforeneligheden af det nyindkøbte materiale med eksisterende DNA-forstærknings metoder. Sequencing meget bevaret gener af individuelle prøver er et meget anvendt og kraftfuldt værktøj til at identificere arter1, såsom bevaret mitokondrie gener, der ofte anvendes som reference gener for Kvalitetsvurderingen af cDNA-biblioteker2 ,3,4,5,6. Den tilgrundliggende begrundelse for den heri præsenterede metode er, at høj bevaring af mitokondrie-gensekvenser i individuelle anonyme østers prøver sammenlignet med de tilsvarende sekvenser af reference genomet indikerer, at andre gener også kan vise en lav grad af divergens, i betragtning af den generelt hurtigere rate af mitokondrie DNA evolution i forhold til nukleare DNA7, tillader forstærkning og isolering af en bred vifte af videnskabeligt og industrielt relevante gener ved blot at bruge offentligt tilgængelige sekvensering af data som reference.
Det overordnede mål med den heri beskrevne metode er at præsentere en optimeret arbejdsgang for at generere en næsten sekvenseret Oyster cDNA bibliotek, som kan bruges som skabelon DNA til kloning af østers gener. I virtuel sekvensering omgås de Novo genom sekvensering; i stedet bruges en kendt, digitalt lagret referencesekvens direkte til at udnytte eller designe primere til produktion af cdnas, der i sidste ende vil omfatte et bibliotek (eller blive føjet til en allerede eksisterende). Målet er at skabe et konvergerende cDNA-bibliotek, hvilket betyder, at ligheder mellem de genererede cDNA-sekvenser og reference sekvensen kan rangeres fra lav til høj divergens. En vigtig fordel ved at bruge cytochrom C oxidase underenhed 1 (COX1) og NADH dehydrogenase (ND) som reference gener er, at selv meget geografisk disjunct østers prøver kan profileret på grund af den høje bevaring af disse mitokondrie gener. Efter at have bevist tilgangen med disse veletablerede markører viser vi derefter dens anvendelse på to enzym kandidater, der er involveret i sukker nukleotid biosyntese og kan være af industriel relevans8,9, 10. det bioteknologiske potentiale i stillehavsøsters er stadig uudforsket. Derfor mener vi, at denne konvergerende metode til forberedelse af et næsten sekvenserede cDNA-bibliotek også vil være hensigtsmæssig for ikke-specialiserede forskere, der ønsker at generere cDNA fra dette relevante biologiske materiale.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den præsenterede protokol giver mulighed for genetisk identifikation af ikke-refererede østers prøver med lignende fænotype fra regionale fiskemarkeder ved sammenligning af COX1 og ND-gener med en offentligt tilgængelig Oyster DNA-genom-database. Betydningen af denne metode ligger i dens enkelhed, da kun en enkelt PCR-reaktion er nødvendig for evalueringen af det virtuelle cDNA-bibliotek. De to bevaret mitokondrie COX1 og ND gener blev forstærket fra et cDNA-bibliotek, som blev genereret ved omvendt transskription…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev delvist støttet af Kinas naturvidenskabelige fundament (tilskudsnummer 31471703, A0201300537 og 31671854 til J.V. og L.L., tilskudsnummer 31470435 til G.Y.) og 100-planen for udenlandske talenter (tilskuds nummeret JSB2014012 til J.V.).
Materials
| Chemicals: | |||
| 1% Triton X-100 | Solarbio | 9002-93-1 | *Alternative distributors possible |
| 2,5-Dihydroxybenzoic acid | Alfa Aesar | 490-79-9 | *Alternative distributors possible |
| Acetonitrile | Merck | 75-05-8 | *Alternative distributors possible |
| Agarose for molecular biology | Biowest Chemicals | 111860 | *Alternative distributors possible |
| Ampicilin | Solarbio | 69-52-3 | *Alternative distributors possible |
| Chloroform | Lingfeng, Shanghai | 67-66-3 | *Alternative distributors possible |
| DEPC water | Thermo Scientific | R0601 | |
| Ethanol | Jinhuada, Guangzhou | 64-17-5 | *Alternative distributors possible |
| Guanidinium thiocyanate-phenol reagent | Invitrogen | 15596018 | TRIzol reagent |
| Imidazole | Energy Chemical | 288-32-4 | *Alternative distributors possible |
| Isopropyl alcohol | Nanjing Chemical Reagent | 67-63-0 | *Alternative distributors possible |
| Isopropyl β-D-thiogalactopyranoside | Solarbio | 367-93-1 | *Alternative distributors possible |
| Kanamycin | Solarbio | 25389-94-0 | *Alternative distributors possible |
| LB Agar | Thermo Fisher | 22700025 | *Alternative distributors possible |
| LB Broth | Thermo Fisher | 10855021 | *Alternative distributors possible |
| Methanol | Jinhuada, Guangzhou | 67-56-1 | *Alternative distributors possible |
| MgCl2 hexahydrate | Xilong Huagong | 7791-18-6 | *Alternative distributors possible |
| NaCl | Xilong Huagong | 7647-14-5 | *Alternative distributors possible |
| NAD+ | Duly Biotech | 53-84-9 | *Alternative distributors possible |
| Phenyl-methylsulfonyl fluoride | Macklin | 329-98-6 | *Alternative distributors possible |
| Tris | Solarbio | 77-86-1 | *Alternative distributors possible |
| UDP-glucose | Wuhu Nuowei Chemicals | 28053-08-9 | *Alternative distributors possible |
| UDP-glucuronic acid | SIGMA | 63700-19-6 | *Alternative distributors possible |
| Tools/Instruments: | |||
| MALDI-TOF mass spectrometer | Bruker | Autoflex | *Alternative distributors possible |
| Metal block heater | Long Yang Scientific Instruments | Thermoshaker HB20 | *Alternative distributors possible |
| PCR thermocycler | Hema | 9600 | *Alternative distributors possible |
| Enzyme and Kits: | |||
| 10×Ligation buffer | Thermo Scientific | B69 | *Alternative distributors possible |
| 5×PrimeSTAR buffer | Takara | 9158A | |
| Alkaline phosphatase | ThermoFisher FastAP | EF0654 | *Alternative distributors possible |
| COX forward primer | Genscript | ATGTCAACAAATCATTTAGACATTG | |
| COX reverse primer | Genscript | ACTTGACCAAAAACATAAGACATG | |
| Cutsmart Buffer | NEB | B7204S | *Alternative distributors possible |
| dNTP mix | Invitrogen | 18427088 | |
| MgUGD forward primer | Genscript | ACATATGACCCTGTCCAAGATCTGTTGT | |
| MgUGD reverse primer | Genscript | ACTCGAGACTCTGTGAGGCGGTGGAG | |
| MgUXS forward primer | Genscript | CCATATGGCAGAATCCTCACAATCAC | |
| MgUXS reverse primer | Genscript | ACTCGAGCACATTTTTGAATTTGCAGACGT | |
| ND forward primer | Genscript | ATGAGATGGCAATTATTTTTTAAT | |
| ND reverse primer | Genscript | ATGTATTTTGGAAAAATCTCCAC | |
| PCR Cleanup Kit | AxyGen | AP-PCR-250 | *Alternative distributors possible |
| pET-30a(+) vector | Merck Millipore | 69909 |
References
- Blaxter, M. L. The promise of a DNA taxonomy. Philosophical transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological. 359 (1444), 669-679 (2004).
- Wen, J., et al. Species identification of dried shellfish (oyster, clam and mussel) products sold on the Chinese market. Food Control. 90, 199-204 (2018).
- Zhang, H., et al. Mitochondrial cob and cox1 genes and editing of the corresponding mRNAs in Dinophysis acuminata from Narragansett Bay, with special reference to the phylogenetic position of the genus Dinophysis. Applied and Environmental Microbiology. 74 (5), 1546-1554 (2007).
- Sell, J., Spirkovski, Z. Mitochondrial DNA differentiation between two forms of trout Salmo letnica, endemic to the Balkan Lake Ohrid, reflects their reproductive isolation. Molecular Ecology. 13, 3633-3644 (2004).
- Karadjian, G., et al. Highly rearranged mitochondrial genome in Nycteria parasites (Haemosporidia) from bats. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (35), 9834-9839 (2018).
- Morga, B., et al. Identification of genes from flat oyster Ostrea edulis as suitable housekeeping genes for quantitative real time PCR. Fish and Shellfish Immunology. 29 (6), 937-945 (2010).
- Delsuc, F., et al. Molecular systematics of armadillos (Xenarthra, Dasypodidae): contribution of maximum likelihood and Bayesian analyses of mitochondrial and nuclear genes. Molecular Phylogenetics and Evolution. 28 (2), 261-265 (2005).
- Wei, S., et al. Discovery and Biochemical Characterization of UDP-Glucose Dehydrogenase from Akkermansia muciniphila. Protein & Peptide Letters. 24 (8), 735-741 (2017).
- Gu, B., et al. Discovery and Biochemical Characterization of the UDP-Xylose Biosynthesis Pathway in Sphaerobacter thermophilus. Protein & Peptide Letters. 23 (12), 1103-1110 (2016).
- Duan, X. C., et al. Functional characterization of the UDP-xylose biosynthesis pathway in Rhodothermus marinus. Applied Microbiology and Biotechnology. 99 (22), 9463-9472 (2015).
- Vogelstein, B., Gillespie, D. Preparative and analytical purification of DNA from agarose. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (2), 615-619 (1979).
- Song, H. B., et al. UDP-glucose 4-epimerase and β-1,4-galactosyltransferase from the oyster Magallana gigas as valuable biocatalysts for the production of galactosylated products. International Journal of Molecular Sciences. 19 (6), 1600 (2018).
- Gainey, P. A., Phelps, C. F. Uridine diphosphate glucuronic acid production and utilization in various tissues actively synthesizing glycosaminoglycans. Biochemical Journal. 128 (2), 215-227 (1972).
