Une stratégie convergente pour la génération d'une bibliothèque d'ADNc pratiquement séquencée à partir d'huîtres du Pacifique non référencées
Summary
Nous décrivons une stratégie pour l’utilisation d’échantillons d’ARN à partir de spécimens d’huîtres du Pacifique non référencés, et évaluons le matériel génétique par comparaison avec les données génomiques accessibles au public pour générer une bibliothèque d’ADNc pratiquement séquencée.
Abstract
L’accès au matériel biologique des espèces de référence, qui ont été utilisés précédemment dans des expériences clés telles que dans le développement de nouvelles lignées cellulaires ou de projets de séquençage du génome, est souvent difficile à prévoir pour d’autres études ou des tiers en raison de la nature consommatrice des échantillons. Bien qu’ils soient maintenant largement répartis sur les côtes du Pacifique de l’Asie, de l’Australie et de l’Amérique du Nord, les spécimens individuels d’huîtres du Pacifique sont génétiquement très diversifiés et ne conviennent donc pas directement comme matériau de départ pour les bibliothèques de gènes. Dans cet article, nous démontrons l’utilisation de spécimens d’huîtres du Pacifique non référencés obtenus sur les marchés régionaux des fruits de mer pour générer des bibliothèques d’ADNc. Ces bibliothèques ont ensuite été comparées au génome d’huîtres accessible au public, et la bibliothèque connexe la plus proche a été sélectionnée à l’aide des gènes de référence mitochondriaux Cytochrome C Oxidase subunit I (COX1) et NADH Dehydrogenase (ND). La pertinence de la bibliothèque d’ADNc générée est également démontrée par le clonage et l’expression de deux gènes codant les enzymes UDP-glucuronic acid dehydrogenase (UGD) et UDP-xylose synthase (UXS), qui sont responsables de la biosynthèse de UDP-xylose de UDP-glucose.
Introduction
L’acquisition de matériel biologique référencé vivant peut être difficile en raison des longs délais de livraison, du raisonnement entrepreneurial ou de la réglementation douanière par pays. Comme alternative, le matériel biologique requis peut également être recueilli à partir de spécimens phénotypiquement identiques. Cependant, ces échantillons peuvent varier considérablement au niveau du génotype, et donc les comparaisons avec les génomes de référence stockés numériquement de la même espèce sont souvent rendues difficiles, voire futiles en raison de l’incompatibilité du matériel nouvellement méthodes d’amplification de l’ADN existantes. Le séquençage des gènes hautement conservés d’échantillons individuels est un outil largement utilisé et puissant pour identifier les espèces1, telles que les gènes mitochondriaux conservés qui sont fréquemment utilisés comme gènes de référence pour l’évaluation de la qualité des bibliothèques d’ADNc2 ,3,4,5,6. La raison sous-jacente de la méthode présentée dans le présent est que la conservation élevée des séquences de gènes mitochondriaux dans des échantillons d’huîtres anonymes individuels par rapport aux séquences correspondantes du génome de référence indique que d’autres gènes peuvent également montrer un faible niveau de divergence, étant donné le taux généralement plus rapide d’évolution de l’ADN mitochondrial par rapport à l’ADN nucléaire7, permettant l’amplification et l’isolement d’un large éventail de gènes scientifiquement et industriellement pertinents en utilisant simplement publiquement données de séquençage disponibles à titre de référence.
L’objectif global de la méthode décrite ci-dessus est de présenter un flux de travail optimisé pour générer une bibliothèque d’ADNc d’huîtres pratiquement séquencée qui peut être utilisée comme modèle d’ADN pour le clonage des gènes de l’huître. Dans le séquençage virtuel, le séquençage du génome de novo est contourné; au lieu de cela, une séquence de référence connue et stockée numériquement est utilisée directement pour utiliser ou concevoir des amorces pour la production de cDNA qui finiront par constituer une bibliothèque (ou être ajoutées à une bibliothèque préexistante). L’objectif est de produire une bibliothèque convergente d’ADNc, ce qui signifie que les similitudes entre les séquences d’ADNc générées et la séquence de référence peuvent être classées de faible à haute divergence. Un avantage clé de l’utilisation de Cytochrome C Oxidase subunit 1 (COX1) et NADH Dehydrogenase (ND) comme gènes de référence est que même les spécimens d’huîtres très disjonctées géographiquement peuvent être profilés en raison de la haute conservation de ces gènes mitochondriaux. Après avoir prouvé l’approche avec ces marqueurs bien établis, nous démontrons alors son application à deux candidats enzymatiques qui sont impliqués dans la biosynthèse des nucléotides de sucre et peuvent être d’une pertinence industrielle8,9, 10. Le potentiel biotechnologique de l’huître du Pacifique est encore inexploré. Ainsi, nous croyons que cette méthode convergente pour la préparation d’une bibliothèque d’ADNc pratiquement séquencée sera également appropriée pour les chercheurs non-spécialistes qui veulent générer de l’ADNc à partir de ce matériel biologique pertinent.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le protocole présenté permet l’identification génétique de spécimens d’huîtres non référencés avec un phénotype similaire provenant des marchés régionaux des fruits de mer en comparant les gènes COX1 et ND avec une base de données du génome de l’ADN des huîtres accessible au public. L’importance de cette méthode réside dans sa simplicité, car une seule réaction PCR est nécessaire pour l’évaluation de la bibliothèque d’ADNc virtuelle. Les deux gènes mitochondriaux conservés de COX1 et de ND ont é…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu en partie par la Fondation des sciences naturelles de Chine (numéros de subvention 31471703, A0201300537 et 31671854 à J.V. et L.L., numéro de subvention 31470435 à G.Y.), et le plan 100 talents étrangers (numéro de subvention JSB2014012 à J.V.).
Materials
| Chemicals: | |||
| 1% Triton X-100 | Solarbio | 9002-93-1 | *Alternative distributors possible |
| 2,5-Dihydroxybenzoic acid | Alfa Aesar | 490-79-9 | *Alternative distributors possible |
| Acetonitrile | Merck | 75-05-8 | *Alternative distributors possible |
| Agarose for molecular biology | Biowest Chemicals | 111860 | *Alternative distributors possible |
| Ampicilin | Solarbio | 69-52-3 | *Alternative distributors possible |
| Chloroform | Lingfeng, Shanghai | 67-66-3 | *Alternative distributors possible |
| DEPC water | Thermo Scientific | R0601 | |
| Ethanol | Jinhuada, Guangzhou | 64-17-5 | *Alternative distributors possible |
| Guanidinium thiocyanate-phenol reagent | Invitrogen | 15596018 | TRIzol reagent |
| Imidazole | Energy Chemical | 288-32-4 | *Alternative distributors possible |
| Isopropyl alcohol | Nanjing Chemical Reagent | 67-63-0 | *Alternative distributors possible |
| Isopropyl β-D-thiogalactopyranoside | Solarbio | 367-93-1 | *Alternative distributors possible |
| Kanamycin | Solarbio | 25389-94-0 | *Alternative distributors possible |
| LB Agar | Thermo Fisher | 22700025 | *Alternative distributors possible |
| LB Broth | Thermo Fisher | 10855021 | *Alternative distributors possible |
| Methanol | Jinhuada, Guangzhou | 67-56-1 | *Alternative distributors possible |
| MgCl2 hexahydrate | Xilong Huagong | 7791-18-6 | *Alternative distributors possible |
| NaCl | Xilong Huagong | 7647-14-5 | *Alternative distributors possible |
| NAD+ | Duly Biotech | 53-84-9 | *Alternative distributors possible |
| Phenyl-methylsulfonyl fluoride | Macklin | 329-98-6 | *Alternative distributors possible |
| Tris | Solarbio | 77-86-1 | *Alternative distributors possible |
| UDP-glucose | Wuhu Nuowei Chemicals | 28053-08-9 | *Alternative distributors possible |
| UDP-glucuronic acid | SIGMA | 63700-19-6 | *Alternative distributors possible |
| Tools/Instruments: | |||
| MALDI-TOF mass spectrometer | Bruker | Autoflex | *Alternative distributors possible |
| Metal block heater | Long Yang Scientific Instruments | Thermoshaker HB20 | *Alternative distributors possible |
| PCR thermocycler | Hema | 9600 | *Alternative distributors possible |
| Enzyme and Kits: | |||
| 10×Ligation buffer | Thermo Scientific | B69 | *Alternative distributors possible |
| 5×PrimeSTAR buffer | Takara | 9158A | |
| Alkaline phosphatase | ThermoFisher FastAP | EF0654 | *Alternative distributors possible |
| COX forward primer | Genscript | ATGTCAACAAATCATTTAGACATTG | |
| COX reverse primer | Genscript | ACTTGACCAAAAACATAAGACATG | |
| Cutsmart Buffer | NEB | B7204S | *Alternative distributors possible |
| dNTP mix | Invitrogen | 18427088 | |
| MgUGD forward primer | Genscript | ACATATGACCCTGTCCAAGATCTGTTGT | |
| MgUGD reverse primer | Genscript | ACTCGAGACTCTGTGAGGCGGTGGAG | |
| MgUXS forward primer | Genscript | CCATATGGCAGAATCCTCACAATCAC | |
| MgUXS reverse primer | Genscript | ACTCGAGCACATTTTTGAATTTGCAGACGT | |
| ND forward primer | Genscript | ATGAGATGGCAATTATTTTTTAAT | |
| ND reverse primer | Genscript | ATGTATTTTGGAAAAATCTCCAC | |
| PCR Cleanup Kit | AxyGen | AP-PCR-250 | *Alternative distributors possible |
| pET-30a(+) vector | Merck Millipore | 69909 |
References
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