VirWaTest، طريقة نقطة الاستخدام للكشف عن الفيروسات في عينات المياه
Summary
هنا نقدم VirWaTest، وهو طريقة بسيطة وبأسعار معقولة والمحمولة لتركيز وكشف الفيروسات من عينات المياه في نقطة الاستخدام.
Abstract
وقد تلوث الفيروسات التي يفرزها البشر والحيوانات مصادر المياه وتشكل خطرا على صحة الإنسان عندما تستخدم هذه المياه للشرب والري الغذائي والغسيل وما إلى ذلك. مؤشر البكتيريا البرازية الكلاسيكية لا يتحقق دائما من وجود مسببات الأمراض الفيروسية وبالتالي فإن الكشف عن مسببات الأمراض الفيروسية والمؤشرات الفيروسية هو ذات الصلة من أجل اعتماد تدابير التخفيف من المخاطر، وخاصة في السيناريوهات الإنسانية وفي المناطق حيث الفاشيات الفيروسية المنقولة بالمياه متكررة.
وفي الوقت الحاضر، تتوفر عدة اختبارات تجارية تسمح بالقياس الكمي لبكتيريا مؤشرات البراز (FIB) للاختبار عند نقطة الاستخدام. غير أن هذه الاختبارات التجارية غير متاحة للكشف عن الفيروسات. يتطلب الكشف عن الفيروسات في عينات المياه البيئية تركيز عدة لترات في أحجام أصغر. وعلاوة على ذلك، فإن الكشف عن الفيروسات، بمجرد تمركزه، يعتمد على أساليب مثل استخراج الأحماض النووية والكشف الجزيئي (مثل تفاعل البوليميراز المتسلسل ( اختبار مضاد للفيروسات الكلى) للجينوم الفيروسي.
الطريقة الموصوفة هنا تسمح بتركيز الفيروسات من عينات المياه 10 L، فضلا عن استخراج الأحماض النووية الفيروسية في نقطة الاستخدام، مع معدات بسيطة ومحمولة. ويسمح ذلك باختبار عينات المياه عند نقطة الاستخدام لعدة فيروسات وهو مفيد في السيناريوهات الإنسانية، وكذلك في أي سياق لا يتوفر فيه مختبر مجهز. وبدلاً من ذلك، تسمح هذه الطريقة بتركيز الفيروسات الموجودة في عينات المياه وشحن المركز إلى مختبر في درجة حرارة الغرفة لمزيد من التحليل.
Introduction
وخلال المراحل الأولى من أي حالة طوارئ إنسانية، فإن الحصول على إمدادات المياه النظيفة والمرافق الصحية والنظافة الصحية أمر بالغ الأهمية لبقاء المتضررين. ولذلك، فإن رصد نوعية المياه يمثل أولوية لمنع تفشي الأمراض المنقولة بالمياه. ومن المعروف جيدا أن المياه الملوثة هي في كثير من الأحيان أصل الأمراض، ولكن من الصعب في كثير من الأحيان تحديد مصادر الفاشيات الفيروسية مثل فيروس التهاب الكبد E (HEV)، حتى مع توافر الأساليب المختبرية التقليدية. ويستند التحكم في نوعية المياه على القياسالكمي لFIB 1،2،3،4. ومع ذلك، فقد تم توثيق على نطاق واسع أنه لا يوجد ارتباط بين عدم وجود FIB ووجود مسببات الأمراض الفيروسية المنقولة بالمياه مثل فيروس الروتا (RoV)، نوروفيروس (NoV)، أو HEV5،6. وبالتالي، فإن استخدام معايير نوعية المياه استناداً إلى FIB قد يؤدي إلى التقليل من تقدير المخاطر المرتبطة بوجود مسببات الأمراض الفيروسية المنقولة بالمياه. مراقبة فيروسات المؤشر، مثل الفيروسات الغدية البشرية (HAdV)، أو مسببات الأمراض المحددة ستكون مفيدة في تحديد التعرض للأمراض الفيروسية وتحديد المصدر المحتمل للعدوى البشرية7،8، 9و10 وفي التحقق من فعالية تدابير الصرف الصحي11.
وحتى الآن، كان الكشف عن الفيروسات في هذه السيناريوهات يعتمد على موظفين مهرة ولوجستيات معقدة. يهدف VirWaTest (virwatest.org) إلى تطوير طريقة بسيطة وميسورة التكلفة ومحمولة لتركيز الفيروسات من عينات المياه والكشف عنها لاحقاً عند نقطة الاستخدام.
ويستند تركيز الفيروس على مبدأ التذليل العضوي لعينات المياه 10 لتر، والتي يتم من خلالها استرداد الفيروسات في أحجام أصغر12،13. يتم جمع flocs وإضافتها إلى المخزن المؤقت الذي يتحلل الفيروسات ويمنع الأحماض النووية من التدهور عند تخزينها في درجة حرارة الغرفة لمدة لا تزيد عن 2 أسابيع.
ويستند أسلوب استخراج الأحماض النووية على استخدام الجسيمات المغناطيسية التي تحصل على الأحماض النووية الناضسة. ويمكن نقلها من مخزن للغسيل إلى آخر وأخيرا إلى المخزن المؤقت elution باستخدام ماصة المغناطيسية التي تعلق الجسيمات. يمكن شحن تعليق الأحماض النووية الفيروسية التي تم الحصول عليها إلى مختبر مرجعي حيث يمكن إجراء الكشف باستخدام الطرق الجزيئية على أساس PCR. لكل استخراج الحمض النووي، يتم اختبار اثنين من كميات مختلفة لاستبعاد تثبيط الأنزيمية التي نشأت من قبل العينة. وبدلاً من ذلك، مع الحد الأدنى من توافر المعدات، يمكن إجراء اختبارات PCR عند نقطة الاستخدام. تم تصميم العملية برمتها ليتم تنفيذها بشكلمستقل عن إمدادات الطاقة (الشكل 1).
وقد تم تكييف فحص كمية لـ PCR للكشف عن HAdV، الذي يفرزه البشر والموجود في عينات مياه الصرف الصحي بتركيزات عالية، ليتم تشغيله عند نقطة الاستخدام. يتم استخدام HAdV كمؤشرات فيروسية البراز البشري. كما تم تكييف PCR للقياس الكمي للبكتيريا MS2 منذ استخدام MS2 في VirWaTest كمراقبة العملية. يمكن تخصيص الأسلوب للكشف عن أي فيروس ذي أهمية.
وبعد التطوير، طبق المستعملون طريقة VirWaTest في مكانين مختلفين في جمهورية أفريقيا الوسطى وإكوادور، مما يوفر تغذية مرتدة بشأن تطبيق البروتوكول في حالات حقيقية.
على حد علمنا، هذا هو الإجراء الأول الذي يسمح بتركيز وكشف الفيروسات في نقطة الاستخدام، بغض النظر عن أي إمدادات الطاقة، والمعدات الكبيرة، وظروف التجميد / التبريد. من المستحسن جمع نسختين من كل عينة من عينات المياه من أجل الحصول على نتائج قوية.
Protocol
Representative Results
Discussion
طريقة VirWaTest تمكن من تركيز الفيروسات واستخراج الحمض النووي من عينات المياه في نقطة الاستخدام من قبل المستخدمين غير ذوي الخبرة. وهو بروتوكول بأسعار معقولة وسريعة وبسيطة. ويستند التركيز على مبدأ التفلح العضوي باستخدام الحليب منزوع الدسم، والتي من خلالها انخفاض درجة الحموضة وظروف الموصلية ا…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
كان VirWaTest مشروع بحثي ممول من برنامج صناديق الابتكار الإنساني التابع لـ ELHRA (تعزيز التعلم والبحث من أجل المساعدة الإنسانية). ويعترف المؤلفون بأفرقة المياه والصرف الصحي والنظافة الصحية التي تكرمت بالتعاون في هذه الدراسة. ومولت تحليل العينات في إكوادور منظمة أوكسفام في إكوادور وإدارة بحوث جامعة الأمريكتين. BRT.17.01. S. Bofill-Mas هو زميل سيرا هنتر في جامعة برشلونة.
Materials
| 5x HOT FIREPol Probe qPCR Mix Plus (ROX) | Solis BioDyne | 08-14-00001 | Includes Solis Biodyne's 5x HOT FIREPol Probe qPCR Mix Plus (qPCR Mix), 50 Reactions |
| 8-Microtube Strips with Caps | dD Biolab | 840637 | Low Profile, Thin Walls, Adapted for Quantitative and Qualitative PCR |
| Aquagenx CBT E. coli Kit | Aquagenx, LLC | ECCBT10 | 10 Tests per Kit |
| Batteries and Power Adapters for Magnetic Stirrer | GenIUL | 900011674 | Includes 12V car power adapter |
| Bucket Support | GenIUL | 900011648 | Aluminium support |
| Bucket, 10 L | Cater4You | 10LTR | Polypropilene, Tamperproof, Clear color |
| Centrifuge Tube, 50 mL | LabBox | CTSP-E50-050 | Polypropylene, Sterile, Graduated, With Skirt |
| Citric Acid 1-Hydrate, 500 g | PanReac AppliChem | 1410181211 | Pure, Pharma Grade, 1 Kilogram |
| Clear PET Bottle | LabBox | FPET-500-088 | Clear Color, PET, Cap Not Included |
| Difco Skim Milk, 500 g | Becton Dickinson | 232100 | Dehydrated |
| DNA/RNA Shield, 250 mL | Zymo Research | R1100-250 | DNA/RNA Preservation Medium, 250 mL |
| Easy9 Pipette Controller | LabBox | EAS9-001-001 | 0.3 μm filter, Pipettes from 0.1 to 100 mL, Autoclavable silicone pipette holder |
| Eppendorf Tube, 0.5 mL | Eppendorf | 0030121023 | Polypropilene, Safe-Lock |
| Eppendorf Tube, 2 mL | Eppendorf | 0030120094 | Polypropilene, Safe-Lock |
| Eppendorf Tube, 5 mL | dD Biolab | 999542 | Polypropylene, Sterile, Graduated |
| Ethanol 96% V/V, 1 L | Panreac AppliChem | 361085-1611 | For UV, IR and HPLC |
| Laboratory Tweezers | LabBox | FORS-007-002 | Thin, Curved End, L= 120 mm |
| Magnetic Stirrer | GenIUL | 900017000 | Battery-powered |
| Marker | dD Biolab | 929203 | Black, Extra fine Tip, Water Resistant, Fast Drying, For Plastic and Glassware |
| Micro Rota-Rack for Microtubes | dD Biolab | 37782 | 4 Modules, L x W x H= 208 x 100 x 100 mm |
| Mini8 Real-Time PCR Cycler | Coyote Biosciences, China | Mini-8 | Portable, Works with 12V Power Supplies or External Batteries, Two channels, Capacity for 8 Tubes |
| NucliSens Lysis Buffer | Biomerieux | 200292 | Reagents for up to 48 Isolations, Store at Ambient Temperature |
| Open Tip Serological Pipette, 10 mL | Deltalab | 900136N | Sterile, Individually Wrapped (Paper/Plastic) |
| PE Screw Cap PP28 | LabBox | TP28-004-020 | For PET Bottles |
| pH Indicator Strip | LabBox | WSPH-001-001 | Range pH 2.8 to pH 4.4, 50 Strips per Pack |
| Plastic Test Tube | Quimikals | 300913 | Includes Cap |
| Polyethylene Pasteur Pipette | LabBox | PIPP-003-500 | Graduated, 7 mL Overall Volume, Non-Sterile |
| Polypropylene Screw Flask With Screw Cap, 150 mL | Deltalab | 409726 | Screw cap, Sterile, graduated up to 100 mL |
| Polypropylene Screw Flask With Screw Cap, 60 mL | Deltalab | 409526G | Screw cap, Sterile, Graduated up to 50 mL |
| Powder Powder Detergent | – | – | Regular Powder Soap for washing clothes |
| Power Cables for Magnetic Stirrer | GenIUL | 900011692 | Connection between batteries and magnetic stirrers |
| QuickPick Magnetic Tool | BioNobile | 24001 | Hand-held tool for magnetic particles |
| QuickPick Tips in Box | BioNobile | 24296 | RNase-Free, Autoclaved, 96 Units |
| QuickPick XL gDNA Magnetic Particles | BioNobile | SN51100 | 3.2 mL |
| Sea Salts | Sigma-Aldrich | S9883-500G | An artificial salt mixture closely resembling the composition of the dissolved salts of ocean water |
| Silicone Tubing | LabBox | SILT-006-005 | Roll of 5 Meters, Inner ø x Outer ø= 6 x 10 mm |
| Sodium Hydroxide Pellets, 98.5 – 100.5% | VWR Chemicals | 28244295 | Pellets, 1 Kg |
| Solar Rotary Platform | SOL-EXPERT Group | 70020 | Acrylic Plate, 10 RPM, Supports up to 300 Grams |
| SOLIScript 1-step Probe Kit | Solis BioDyne | 08-57-00250 | Includes Solis Biodyne's 5x One-Step Probe Mix (qPCR Mix) and 40x One-Step SOLIScript Mix (Reverse Transcriptase Enzyme), 250 Reactions |
| SPEEDTOOLS RNA Virus Extraction Kit | BioTools | 21.141-4197 | Includes BioTools's BAW Buffer (Washing Buffer 1), BAV3 Buffer (Washing Buffer 2 and 3) and BRE Buffer (Elution Buffer). |
| SpinBar Octhaedral Stirring Magnet | dD Biolab | 045926 | Pivot Ring, L x ø = 38 x 8 mm, Blue |
| Tape-End Serological Pipette, 10 mL | Deltalab | PN10E1 | Sterile, Individually Wrapped (Paper/Plastic) |
| Tape-End Serological Pipette, 50 mL | Deltalab | 900043 | Sterile, Individually Wrapped (Paper/Plastic) |
| Termi-DNA-Tor – Nucleic Acid Remover | BioTools | 22001-4291 | Remover of nucleic acids, bacteria, fungi and mycoplasma from material and surfaces, 450 mL |
| Water Molecular Biology Reagent, 1L | Sigma-Aldrich | W4502-1L | Nuclease and Protease Free, 0.1 μm Filtered |
| Whirl-Pak Bag, 540 mL | Deltalab | 200361 | Stable bottom |
| Zip Lock Plain Bag | LabBox | BZIP-080-100 | Polyethylene, L x W= 120 x 80 mm |
References
- The Sphere Project. . The Sphere Project: Humanitarian Charter and Minimum Standards in Humanitarian Response. , (2011).
- Bartram, J., et al. . Water Safety Plan Manual:Step-by-step risk management for drinking-water suppliers. , (2009).
- World Health Organization. . Guidelines for Drinking-water Quality. , (2011).
- World Health Organization. . 25 Years Progress on Sanitation and Drinking Water. , (2015).
- Girones, R., et al. Molecular detection of pathogens in water – The pros and cons of molecular techniques. Water Research. 44 (15), 4325-4339 (2010).
- Rodriguez-Manzano, J., et al. Standard and new fecal indicators and pathogens in sewage treatment plants, microbiological parameters for improving the control of reclaimed water. Water Science and Technology. 66 (12), 2517-2523 (2012).
- Puig, M., et al. Detection of adenoviruses and enteroviruses in polluted waters by nested PCR amplification. Applied and Environmental Microbiology. 60 (8), 2963-2970 (1994).
- Carter, M. J. Enterically infecting viruses: Pathogenicity, transmission and significance for food and waterborne infection. Journal of Applied Microbiology. 98 (6), 1354-1380 (2005).
- Bofill-Mas, S., Pina, S., Girones, R. Documenting the epidemiologic patterns of polyomaviruses in human populations by studying their presence in urban sewage. Applied and Environmental Microbiology. 66 (1), 238-245 (2000).
- Bofill-Mas, S., et al. Quantification and stability of human adenoviruses and polyomavirus JCPyV in wastewater matrices. Applied and Environmental Microbiology. 72 (12), 7894-7896 (2006).
- Rames, E., Roiko, A., Stratton, H., Macdonald, J. Technical aspects of using human adenovirus as a viral water quality indicator. Water Research. 96, 308-326 (2016).
- Calgua, B., et al. Development and application of a one-step low cost procedure to concentrate viruses from seawater samples. Journal of Virological Methods. 153 (2), 79-83 (2008).
- Bofill-Mas, S., et al. Cost-effective method for microbial source tracking using specific human and animal viruses. Journal of Visualized Experiments. 58, 5-9 (2011).
- International Organization for Standardization. . ISO 10705-1:1995: Water quality – Detection and enumeration of bacteriophages – Part 1: Enumeration of F-specific RNA bacteriophages. , (1995).
- Hernroth, B. E., Conden-Hansson, A. C., Rehnstam-Holm, A. S., Girones, R., Allard, A. K. Environmental factors influencing human viral pathogens and their potential indicator organisms in the blue mussel, Mytilus edulis: the first Scandinavian report. Applied and Environmental Microbiology. 68 (9), 4523-4533 (2002).
- Pecson, B. M., Martin, L. V., Kohn, T. Quantitative PCR for determining the infectivity of bacteriophage MS2 upon inactivation by heat, UV-B radiation, and singlet oxygen: Advantages and limitations of an enzymatic treatment to reduce false-positive results. Applied and Environmental Microbiology. 75 (17), 5544-5554 (2009).
- Calgua, B., Barardi, C. R. M., Bofill-Mas, S., Rodriguez-Manzano, J., Girones, R. Detection and quantitation of infectious human adenoviruses and JC polyomaviruses in water by immunofluorescence assay. Journal of Virological Methods. 171 (1), 1-7 (2011).
- Bofill-Mas, S., et al. Cost-effective method for microbial source tracking using specific human and animal viruses. Journal of Visualized Experiments. (58), e2820 (2011).
- Gonzales-Gustavson, E., et al. Characterization of the efficiency and uncertainty of skimmed milk flocculation for the simultaneous concentration and quantification of water-borne viruses, bacteria and protozoa. Journal of Microbiological Methods. 134, 46-53 (2017).
