Summary
Her presenterer vi en protokoll som beskriver isolering og dyrking av brusk explants fra storfe knær. Denne metoden gir et enkelt og tilgjengelig verktøy for å beskrive vevs endringer som følge av biologiske stimuli eller nye legemiddel selskap som er målrettet mot leddet.
Abstract
Ex vivo kultur systemer dekker et bredt spekter av eksperimenter dedikert til å studere vev og cellulær funksjon i en innfødt setting. Brusk er et unikt vev viktig for riktig funksjon av synovial felles og er konstituert av en tett ekstracellulære matrise (ECM), rik på proteoglycan og type II kollagen. Chondrocytes er den eneste celletypen som finnes i brusk og er utbredt og relativt lav i antall. Endrede eksterne stimuli og cellulær signal kan føre til endringer i ECM sammensetning og forringelse, som er viktige patologiske kjennetegn i sykdommer som artrose (OA) og revmatoid artritt.
Ex vivo brusk modeller tillate 1) profilering av chondrocyte mediert endringer av brusk vev omsetning, 2) visualisere brusk ECM sammensetning, og 3) chondrocyte omorganisering direkte i vevet. Profilering av disse endringene som svar på stimuli eller behandlinger er av stor betydning i ulike aspekter av brusk biologi, og utfylle in vitro eksperimenter i isolerte chondrocytes, eller mer komplekse modeller i levende dyr der eksperimentelle forhold er vanskeligere å kontrollere.
Brusk explants presentere en translational og lett tilgjengelig metode for å vurdere vev remodeling i brusk ECM i kontrollerbar innstillinger. Her beskriver vi en protokoll for å isolere og dyrking lever storfe brusk explants. Metoden bruker vev fra storfe kneet, som er lett tilgjengelig fra den lokale slakteri. Både explants og conditioned kultur medium kan analyseres for å undersøke vev omsetning, ECM sammensetning, og chondrocyte funksjon, og dermed profilering ECM moduleringshjul.
Introduction
Chondrocytes produsere og vedlikeholde brusk matrise. For å studere biologi av chondrocytes og hvordan de og de omkringliggende ECM reagerer på eksterne stimuli, er det avgjørende å forhøre dem i sitt eget miljø1,2. Studere brusk omsetning er viktig å øke forståelsen av de underliggende mekanismene i leddsykdommer som OA, en sykdom som det er for tiden ingen sykdom modifisere behandling. Følgelig er det et betydelig behov for bedre oversettelse modeller2.
Ex vivo karakterisering av celle-og vevs effekter er viktig å utfylle andre prekliniske modeller, både in vitro, slik som chondrocyte monolag kulturer, og in vivo, som kirurgi-indusert OA modeller eller autoimmune kollagen-indusert artritt modell (CIA ). Tallrike studier har fremhevet forskjellene mellom hvordan cellene oppfører seg i 2D-monolag kulturer og 3D-strukturer eller i sitt eget vev3,4. Mange celler i 2D lag vedta unaturlig morfologier, inkludert forskjeller i celle polaritet og vev vedlegg, noe som resulterer i både visuelle og funksjonelle forskjeller i celler innen native vev5. Forskjellene er også tydelig i funksjonaliteten til cellene, som kan skifte protein uttrykk, som fører til dypt endrede differensiering mønstre, regulatoriske maskiner, og celle funksjonalitet5,6,7 ,8.
Brusk ECM består hovedsakelig av type II kollagen som gir en matrise rammeverk, og aggrecan, en proteoglycan som bidrar til å beholde væske i vevet. Andre Matrix molekyler som kollagen type IV, VI, IX, X, XI, XII, fibronektin, brusk oligomer protein (COMP), biglycan, decorin, og perlecan er også til stede9.
Mens etiologi av OA er fortsatt uklart10,11, er utbruddet av sykdommen antas å være forårsaket av ubalanser i vev omsetning og reparasjonsprosesser12,13. Nedbrytning av ledd brusk er et kjennetegn på OA. Brusk-Resident chondrocytes eller celler i omkringliggende vev øke sin frigjøring av cytokiner, stimulere forhøyet produksjon av proteinaser som matrise metalloproteinases (MMPs) og aggrecanases, som øker nedbrytning av brusk ECM 14. denne degradering resulterer i utgivelsen av små unike protein fragmenter kalt neo-epitopes, som kan kvantifisert i serum, urin, eller kultur medium15. Ved dannelse og modning av kollagen, såkalte profragments er også utgitt; Disse kan være kvantifisert som et mål på matrise produksjon16.
Målet med denne protokollen er å etablere en ex vivo brusk modell for å sammenligne effekten av stimulering og/eller narkotikabehandling på ECM vev omsetning. Brusk omsetning er profilert ved å måle matrise-avledet neo-epitope biomarkører direkte i betinget kultur medium bruker ELISA: AGNx1 (reflekterende aggrecanase aktivitet), C2M (reflekterende matrise MMP aktivitet), og ProC2 (reflekterende type II kollagen og formasjon). Funnene kan verifiseres ved histologiske farging av ECM, som også visualiserer organiseringen av chondrocytes i den enkelte explants. Den beskrevne protokollen kan brukes til å teste effekten av romanen behandlinger på chondrocyte funksjon og brusk ECM omsetning. En rekke studier har brukt brusk explants å beskrive biologiske prosesser eller effekten av intervensjon på cytokin-utfordret explants bruker kvantitative histologiske eller immunhistokjemiske tilnærminger, mRNA, protein uttrykk, eller Proteomikk2 ,17,18. Disse protokollene er imidlertid utenfor omfanget av det nåværende manuskriptet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. vevs isolasjon
- Vev sourcing
- Utfør hele vevs genererings delen utenfor en laminær i et aseptisk miljø.
- Fra den lokale slakteri, få en hel fersk storfe tibiofemoral kneleddet fra kalver mellom 1,5 og 2 år.
- Forsiktig analysere kalven kneet ved først å fjerne overflødig kjøtt, avdekke Kondyler, menisk, sener, og synovial membran. Skjær sener og synovial membran, slik at skjøten til dismember. Fjern menisk for å avdekke lår Kondyler.
- Isoler explants fra bære området i lår Kondyler ved hjelp av en 3 mm biopsi puncher og løsne dem fra ledd flaten ved å skjære med en skalpell parallelt med og så nær subchondral benet som mulig. Den harde strukturen av subchondral benet bør sikre at explants ikke inneholder forkalket matrise. Streve for explants med uniform høyde.
- Umiddelbart lagre og bland explants i DMEM/F12-GlutaMAX + 1% P/S kultur medium i en 50 mL tube eller Petri parabolen. Ikke bland explants fra forskjellige kua knær, men hold separat for hver studie.
- Vev dyrking
- Overfør explants til en steril 96 brønn plate i en laminær strømnings hette.
- Vask explants 3 ganger i kultur medium eller PBS og kultur dem i 200 μL av kultur medium per brønn til starten av eksperimentet. Bruk en bleke periode på 1 dag for å synkronisere biopsi Cellular aktivitet og passiv biomarkør utgivelse.
- Kultur explants opp til 10 uker i en 37 ° c inkubator med 5% CO2. Plasser alle replikerer innenfor hver gruppe diagonalt i kultur platen for å minimere variasjonen indusert av fordampning. For ytterligere å unngå fordamping av supernatanten, legge PBS til de ytre brønnene av kulturen plate.
2. storfe brusk explant behandling og vurdering av metabolsk aktivitet
- Kultur medium endring og behandling
- Endre kulturen medium enhver 2-3 dager inne en laminær flyte Hood.
- Hvis du bruker noen behandlinger, forberede disse før du endrer mediet. Forbered behandlingene til ønsket konsentrasjon i de explant brønnene ved fortynning i kultur mediet.
- Forsiktig fjerne supernatanten fra hver brønn og overføre den til en ny 96 brønn plate. Oppbevar supernatanten med tetningsbånd ved − 20 ° c for biomarkør analyse av vevs omsetning og protein uttrykk.
- Umiddelbart tilsett 200 μL av ferskt kultur medium eller behandling per brønn. Ikke la explants tørke ut under medium endring og sikre at alle explants er helt neddykket i det nye mediet.
- Resazurin farging
- Mål metabolsk aktivitet en gang ukentlig som en indirekte måling av celle levedyktighet. Den resazurin testen er en enkel måte å vurdere om metabolsk aktivitet av explants forverres for en individuell explant på grunn av celle død eller cellulære endringer. Explants i kultur medium alene har en relativt stabil resazurin lesing gjennom hele eksperiment perioden.
- Lag en løsning av kultur medium med 10% resazurin.
- Høste supernatanten som beskrevet i trinn 2.1.3.
- Dypp explants i 10% resazurin løsning for 3 timer ved 37 ° c eller til supernatanter blir lilla. Inkluder 4 brønner uten explants som bakgrunnskontroller.
- Overfør den conditioned og bakgrunn kontroll resazurin løsning til en svart mikrotiterbrønnene plate og måle fluorescens ved 540 NM eksitasjon/590 NM utslipp.
- Vask grundig 3 ganger i kultur medium eller PBS og senk explants i vaske medium i 5-10 min slik at resazurin helt diffus ut. Legg til nytt kultur medium eller behandlinger hvis brukt.
3. oppsigelse, fiksering og prøve lagring
- Oppsigelse av dyrking perioden
- Mål den metabolske aktiviteten som beskrevet i trinn 2,2. Tilsett 200 μL av PBS per brønn.
- Fiksering og oppbevaring
- Fjern PBS, tilsett 200 μL av formaldehyd per brønn, og la stå i 2 timer ved romtemperatur.
- Kast formaldehyd og tilsett 200 μL av PBS per brønn. Dekkplaten med tetningsbånd, og oppbevar ved 4 ° c for histochemical analyse. Vi anbefaler at du utfører histochemical analyse innen 3 måneder.
4. vevs omsetning biomarkører (ELISA)
- Indirekte konkurransedyktige ELISAs
- Coat en streptavidin-plate med den spesifikke biotinylated analysen mål-peptid fortynnet 1:100 i analysen buffer (100 μL per brønn) i 30 min ved 20 ° c.
- Vask 5 ganger med standard vaskebuffer og tilsett sample-supernatanten (20 μL per brønn) sammen med primært monoklonale antistoff mot analysen målet-peptid fortynnet 1:93.3 for ProC2 og 1:100 i analysen buffer for AGNx1 (100 μL per brønn) og ruge for 2 t ved 20 ° c med risting for ProC2 og 3 t ved 20 ° c for AGNx1.
Merk: prøvevolumet tas direkte fra de lagrede supernatanten platene. Hvis den målte konsentrasjonen er ute av analysen måleområdet, fortynne supernatanten i en v-bunn fortynning plate i PBS eller analysen buffer. - Vask 5 ganger med standard vaskebuffer og ruge med peroksidase-merket sekundært antistoff fortynnet 1:100 i analysebuffer (100 μL per brønn) for 1 t ved 20 ° c.
- Vask 5 ganger med standard vaskebuffer og ruge med risting i 15 minutter i mørket ved 20 ° c med tetramethylbenzidine (TMB) som et peroksidase substrat (100 μL per brønn).
- Avslutt reaksjonen med standard stopp løsning, 0,1 M H2så4 (100 μL per brønn).
- Les fargemetrisk reaksjonen ved 450 nm absorbansen ved hjelp av en referanse absorbansen ved 650 NM på en standard laboratorie plate leser.
- Direkte konkurrerende ELISAs for måling av brusk vev omsetningen i supernatanten
Merk: denne kvantifiserer C2M.- Coat en streptavidin-plate med spesifikke biotinylated analysen mål-peptid fortynnet 1:100 i analysen buffer (100 μL per brønn) i 30 min ved 20 ° c.
- Vask 5 ganger med vaskebuffer og tilsett prøve-supernatanten sammen med 100 μL av peroksidase-merket monoklonale antistoff mot analysen målet-peptid fortynnet 1:100 i analysen buffer (20 μL per brønn). Ruge for 20 timer ved 2 – 8 ° c med risting.
Merk: prøvevolumet tas direkte fra de lagrede supernatanten platene. Hvis den målte konsentrasjonen er ute av analysen måleområdet, fortynne supernatanten i en v-bunn fortynning plate i PBS eller analysen buffer. - Vask 5 ganger med standard vaskebuffer og ruge med risting i 15 minutter i mørket ved 20 ° c med TMB som et peroksidase substrat (100 μL per brønn).
- Avslutt reaksjonen med standard stopp løsning, 0,1 M H2så4 (100 μL per brønn).
- Les fargemetrisk reaksjon ved 450 nm absorbansen med en referanse absorbansen ved 650 NM på en standard laboratorie plate leser.
- AGNx1
- Kvantifisere aggrecan degradering ved å måle utgivelsen av AGNx1 neo-epitope. Denne indirekte konkurransedyktige ELISA analysen mål aggrecan C-terminal peptid (NITEGE373) generert av ADAMTS-4 og 5 kløft. Det monoklonale antistoff anerkjenner alle fragmenter med en eksponert NITEGE-epitope. Den eksperimentelle detaljer om analysen har blitt publisert andre steder19.
- ProC2
- Kvantifisere type II kollagen formasjon ved å måle utgivelsen av profragment av type II kollagen. Denne indirekte konkurransedyktige ELISA analysen mål epitope av PIIBNP propeptide (QDVRQPG) generert av N-propeptidases under trimming av nylig syntetisert type II kollagen. Den eksperimentelle detaljer om analysen har blitt publisert andre steder16.
- C2M
- Kvantifisere type II kollagen degradering ved å måle utgivelsen av C2M neo-epitope fragment. Denne direkte konkurransedyktige ELISA anerkjenner MMP-kløyvde C-terminal peptid (KPPGRDGAAG1053). Denne analysen er forskjellig fra AGNx1 og ProC2 som det er den primære antistoff som er peroksidase-merket og dermed brukes som detektor. Den eksperimentelle detaljer om analysen har blitt publisert andre steder20.
5. histologiske analyse
- Infiltrasjon, innebygging og skjæring
- Plasser den fiksert explants (se trinn 3,2) i individuelt merkede kassetter. Ta med både en etikett i kassett-og etikett kassettene for å sikre identifikasjon.
- Overfør kassettene som inneholder explants, til en vevs prosessor maskin. Deretter infiltrere explants med parafin i en serie av dehydrering og para fin infiltrasjon trinn.
- Tørke med 96% etanol for 90 min uten temperatur justering. Gjenta dette trinnet 3 ganger.
- Tøm etanol med toluen for 90 min uten temperatur justering. Gjenta dette trinnet to ganger.
- Tøm etanol med toluen for 90 min ved 60 ° c.
- Infiltrere med parafinvoks i 30 min ved 60 ° c.
- Infiltrere med parafinvoks i 60 min. ved 60 ° c.
- Infiltrere med parafinvoks i 90 min. ved 60 ° c.
- For hvert trinn legger du til løsningene i prøvekammeret med langsom pumpe ut og pumpe-i-renn under 33 – 34 kPa. Kjør infiltrasjon prosessen i en trykk/vakuum-syklus med et maksimalt vakuum på − 65 til − 70 kPa.
- Etter infiltrasjon, plasser kassettene på en varme blokk for å tillate forsiktig fjerning av explants fra kassetten. Legg den infiltrere explants forsiktig inn i individuelle para fin blokker. Med oppvarmet tang, plassere explants med overfladisk ledd brusk og subchondral bein sider vinkelrett på skjære flaten, noe som sikrer visualisering av de ulike brusk lag innenfor hvert eksemplar delen.
- Skjær 5 μm deler av avkjølt parafin-blokker med innebygd explants på en mikrotomen. Overfør snitt delene til et Kaldtvanns bad. Om nødvendig kan seksjoner skilles med enten en skalpell eller et dekkglass.
- Bruk et glass lysbilde forsiktig, Overfør delene til et varmt vannbad (50 ° c), der delene utfolder seg. Løft hver seksjon på et merket deksel lysbilde og plasser på en varm plate i 30 min.
- Plasser lysbildene i en kurv og ruge ved 60 ° c i 1 time, og hold dem over natten ved 37 ° c. Heretter lagrer du lysbilder i lukkede beholdere ved 4 ° c til farging.
- Safranin O/fast Green farging og visualisering
- Plasser lysbildene som skal legges i en kurv, og ruge lysbildene ved 60 ° c for 1 time.
- Klargjør og Filtrer alle reagenser med et filter på 0,45 mm.
- I forberedelsene til farging kan du helle de filtrerte reagensene i kanner til et volum som gjør at løsningene fullstendig dekker lysbildene når de submerging kurven. Kanner som brukes, krevde et volum på 250 mL for å dekke lysbildene.
- Deparaffinize den smeltet lysbildene ved submerging kurven i toluen for 10 min to ganger, 99% etanol for 2 min to ganger, 96% etanol for 2 min to ganger, og 70% etanol for 2 min to ganger. Deretter hydrat lysbildene i vann i 2 min.
- Stain deparaffinized og hydrert lysbilder ved submerging kurven i Weigert ' s Iron Hematoksylin løsning (pH 1,5) i 10 min, dukkert i 1% HCl gang, og skyll med rennende vann fra springen i ca 5 min eller til overflødig farge har vasket bort.
- Neste, flekk inne 0,05% rask grønn løsning (pH: 5,75) for 5 min, dip inne 1% CH3COOH en gang, og flekk inne 0,1% Safranin O (pH: 6,5) for 20 min.
- Tørke og fjerne lysbildene ved å dyppe to ganger i 70% etanol, 96% etanol for 2 min to ganger, 99% etanol for 2 min to ganger, og Toluen 2 min to ganger.
- Monter de ubehandlede glass lysbildene med resinous medium som dekker de histologi lysbildene.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Full dybde explants ble isolert, kultivert og behandlet i 3 uker (figur 1). Kulturen medium ble endret med tillegg av behandling 3 ganger per uke. Når ukentlig, metabolsk aktivitet ble målt ved resazurin analysen. Biomarkører av ECM-omsetning ble målt i supernatanten høstet fra kultur platen 3 ganger per uke. Explants ble delt inn i 4 grupper for behandling: 1) Oncostatin M og TNFα (O + T); 2) O + T + GM6001 (GM6001); 3) insulin som vekstfaktor-1 (IGF-1); og 4) en kontroll uten behandling (w/o).
Metabolsk aktivitet.
For alle fire grupper, metabolsk aktivitet var relativt stabilt gjennom 3 uker (figur 2A). Det var en tendens til IGF-1 å øke metabolsk aktivitet litt over w/o-gruppen og for O + T grupper for å redusere den. Den resazurin analysen ble brukt til å enkelt vurdere aktiviteten av chondrocytes i hver explant og indirekte vurdere celle levedyktighet uten å trekke ut explants fra eksperimentet. Hvis en explant viser en betydelig nedgang i metabolsk aktivitet under eksperimentet, kan explant utelukkes fra videre analyse.
Katabolske behandling.
O + T ble brukt 3 ganger ukentlig til kultur brønner for å undersøke O + T-mediert brusk degradering (Figur 3, Figur 4). MMP-mediert type II kollagen degradering og aggrecanase-mediert aggrecan degradering ble vurdert av C2M og AGNx1 ELISAs. O + T økt type II kollagen degradering fra dager 7-21 (Figur 3a) og aggrecan degradering fra dager 3-14 (Figur 4a) i forhold til w/o gruppen. Når du legger til GM6001 (en bredspektret MMP-inhibitor) i kombinasjon med O + T-behandling, ble O + T-mediert C2M-utgivelsen blokkert (Figur 3a, B). En redusert AGNx1-utgivelse ble observert ved tillegging av GM6001 på dager 3-7, men AGNx1 Release topper på dag 10 på tilsvarende nivå til O + T-gruppen (Figur 4A), som indikerer at GM6001 bare reduserer aggrecan degradering i begrenset grad. Dette mønsteret i AGNx1 og C2M utgivelse er det generelle bildet observert i storfe brusk modellen stimulert med O + T. Først AGNx1 er sluppet fra ca dag 3 og topper på dager 10-14, som representerer en tidlig degradering av aggrecan. Neste, etter 2 ukers dyrking med O + T, type II kollagen degradering er observert målt ved C2M biomarkør.
Anabole behandling.
Å undersøke hvordan anabole stimulering modulerer brusk ECM omsetning, insulin som vekstfaktor-1 (IGF-1) ble brukt 3 ganger ukentlig til storfe full-dybde explants. Effekten av IGF-1 på brusk explants ble hovedsakelig observert på målinger av type II kollagen formasjon, vurdert av ProC2, som forventet for anabole stimuli (figur 5). Dag 0 i denne modellen viser alltid høye ProC2 målinger, kanskje som en reaksjon på utvinning av prøvene. Disse høye nivåene reduseres betydelig og nivå ut fra dager 7-21. Ved behandling med IGF-1, ProC2 nivåene reduseres mindre enn de som er observert i w/o-gruppen, som indikerer at IGF-1 stimulerer type II kollagen formasjon fra dag 7 (figur 5B). ProC2-grafene viser også den biologiske variasjonen av kyr. Explants fra to kyr ble brukt i disse eksperimentene med 6 Explants per ku per gruppe. Den første kua hadde tykkere brusk og genererte større explants, noe som resulterte i høyere ProC2 nivåer ved Baseline, mens den andre kua var mindre med tynnere brusk, noe som resulterer i lavere ProC2 nivåer ved Baseline. For det w/o, IGF-1, og O + T grupper, ProC2 nivåene avbildet representerer gjennomsnittet av explants fra både kyr, men GM6001 ble målt bare i den andre kua med tynnere explants. Dermed startet GM6001 gruppen med lavere ProC2 nivåer på dag 0, som er tydelig i ProC2 området under kurven (AUC) (figur 5C). Normalisering av ProC2 verdier til dag 0 nivåer tar biologisk varians i betraktning, og dermed viser effektiviteten av behandlingen (figur 5B, D).
Safranin O og fast Green histologiske farging ble utført for å visualisere proteoglycan innhold og brusk struktur av explant gjennom hele eksperimentet (figur 6). På dager 0, 7, 14 og 21, explants fra w/o, IGF-1 og O + T gruppen ble fiksert for histologiske farging (figur 6). Den w/o og IGF-1 gruppe syntes å ha lignende Safranin O farging intensitet til dag 0 explant hele eksperimentet, som samsvarer med biomarkør resultater som viser at ingen av de to gruppene økt AGNx1 release (Figur 4). Behandling med O + T resulterte i betydelig proteoglycan tap av innhold på dag 7 og fullstendig tap på dag 21. Videre, fast Green farging intensitet avtar fra dager 14-21, noe som indikerer en kollagen tap i tråd med C2M resultater.
Figur 1: skjematisk oversikt over storfe brusk metoden.
På dag − 1 ble Kondyler av storfe som ble isolert fra bak tibiofemoral leddet. Full-dybde brusk explants ble løslatt fra Kondyler med en skalpell og biopsi puncher. De utpakkede explants ble vasket og overført til en steril 96 brønn kultur plate. På dag 0, 3, 5, 7, 10, 12, 14, 17, 19 og 21 ble supernatanten høstet fra kultur platen, overført til en lagrings plate, og holdt ved − 20 ° c, som illustrert i medium Change trinn 1. Den lagrede supernatanten ble senere tint for måling av vevs omsetningen biomarkører av spesifikke ELISA-analyser. I middels endring trinn 2, etter fjerning av supernatanten, nytt kultur medium som inneholder ulike behandlinger eller ingen behandling for kontroll explants ble brukt. På dag 0, 7, 14 og 21 ble explants inkubert med 10% resazurin løsning for 3 timer etter høsting av supernatanten. Den 10% resazurin supernatanten ble overført til en svart 96 brønn plate der fargemetrisk reaksjonen ble målt. Kultur brønnene ble vasket 3 ganger før nytt kultur medium med eller uten behandling ble lagt til explants som vist i medium Change trinn 2. På dag 21, etter høsting av supernatanten og resazurin måling, explants ble fiksert ved inkubasjons med formaldehyd for 2 h. please Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: metabolsk aktivitet målt ved resazurin.
Storfe full-dybde brusk explants ble isolert og kultivert for 3 uker. Kultur medium ble endret med tillegg av ny behandling 3 ganger per uke (n = 12 explants fra 2 kyr). Behandlingen besto av IGF-1 [100 ng/mL], OSM + TNFα (O + T) [10/20 ng/mL], og O + T [10/20 ng/mL] + GM6001 (GM6001) [10 μM]. En kontrollgruppe uten behandling (w/o) ble inkludert. For det w/o, IGF-1, og O + T gruppe, gjennomsnittlig og standard feil av gjennomsnittet (SEM) av 12 replikerer fra 2 kyr (6 replikerer per ku) vises. For GM6001 gruppen, gjennomsnittlig og SEM av 6 replikerer fra 1 ku vises. (A) metabolsk aktivitet målt ved resazurin. (B) område under KURVEN (AUC) for dager 0-21 for metabolske aktivitets grafer vist i (A). p > 0,0001. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: type II kollagen degradering målt ved C2M.
Storfe full-dybde brusk explants ble isolert og kultivert for 3 uker. Kultur medium ble endret med tillegg av ny behandling 3 ganger per uke. Behandlingen besto av IGF-1 [100 ng/mL], OSM + TNFα (O + T) [10/20 ng/mL], og O + T [10/20 ng/mL] + GM6001 (GM6001) [10 μM]. En kontrollgruppe uten behandling (w/o) ble inkludert. For det w/o, IGF-1, og O + T grupper, gjennomsnittet og SEM av 12 replikerer fra 2 kyr (6 replikerer per ku) vises. For GM6001 gruppen, gjennomsnittlig og SEM av 6 replikerer fra 1 ku vises. (A) C2M målinger. Statistisk betydning nivå av w/o ble beregnet ved gjentatte tiltak (RM) toveis ANOVA med Sidak ' s Multiple sammenligning test. (B) AUC for dager 0-21 for C2M-grafer vist i (A). Statistisk betydning ble beregnet av Kruskal-Wallis test med Dunn ' s Multiple sammenligning test. p > 0,0001. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Bilde 4: Aggrecan forringelse målt ved AGNx1.
Storfe full-dybde brusk explants ble isolert og kultivert for 3 uker. Kultur medium ble endret med tillegg av ny behandling 3 ganger per uke. Behandlingen besto av IGF-1 [100 ng/mL], OSM + TNFα (O + T) [10/20 ng/mL], og O + T [10/20 ng/mL] + GM6001 (GM6001) [10 μM]. En kontrollgruppe uten behandling (w/o) ble inkludert. For det w/o, IGF-1, og O + T gruppe, gjennomsnittet og SEM av 12 replikerer fra 2 kyr (6 replikerer per ku) vises. For GM6001 gruppen, gjennomsnittlig og SEM av 6 replikerer fra 1 ku vises. (A) AGNx1 målinger. Statistisk betydning nivå av w/o ble beregnet av RM toveis ANOVA med Sidak ' s Multiple sammenligning test. (B) AUC for dager 0-21 for AGNx1-grafer vist i (A). Statistisk betydning ble beregnet av Kruskal-Wallis test med Dunn ' s Multiple sammenligning test. * *p > 0,01, * * *p > 0,001, * * * *p > 0,0001. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: type II kollagen formasjon målt ved ProC2.
Storfe full-dybde brusk explants ble isolert og kultivert for 3 uker. Kultur medium ble endret med tillegg av ny behandling 3 ganger per uke. Behandlingen besto av IGF-1 [100 ng/mL], OSM + TNFα (O + T) [10/20 ng/mL], og O + T [10/20 ng/mL] + GM6001 (GM6001) [10 μM]. En kontrollgruppe uten behandling (w/o) ble inkludert. For det w/o, IGF-1, og O + T gruppe, gjennomsnittet og SEM av 12 replikerer fra 2 kyr (6 replikerer per ku) vises. For GM6001 gruppen, gjennomsnittlig og SEM av 6 replikerer fra 1 ku re vist. (A) ProC2 målinger fra dager 0-21. (B) ProC2 verdier normalisert til dag 0 målinger for hver enkelt explant. ProC2-resultatene drar ofte nytte av dag 0 normalisering for å avdekke behandlingseffekten som kan være skjult av de høye biomarkør nivåene på dag 0. I A og B, den statistiske betydning NIVÅET ble beregnet av RM toveis Anova med Sidak ' s Multiple sammenligning test. (C) AUC for dager 0-21 for ProC2 grafer vist i (A). (D) AUC for dager 0-21 for dag 0 normalisert ProC2 grafer vist i (B). I C og D, den statistiske betydningen ble beregnet av Kruskal-Wallis test med Dunn ' s Multiple sammenligning test. * *p > 0,01, * * *p > 0,001, * * * *p > 0,0001. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6: histologiske visualisering av proteoglycan innhold ved Safranin O/fast Green farging.
Storfe full-dybde brusk explants ble isolert og kultivert for 3 uker. Kultur medium ble endret med tillegg av ny behandling 3 ganger per uke. Behandlingen besto av IGF-1 [100 ng/mL] og OSM + TNFα (O + T) [10/20 ng/mL]. En kontrollgruppe uten behandling (w/o) ble inkludert. På dag 0, 7, 14, og 21, explants ble fiksert, infiltrere med parafin, innebygd i parafin, skiver, plassert på forsiden lysbilder, og beiset med hematoksylin, Safranin O, og fast Green. For hver behandlingsgruppe og hver timepoint vises en representativ explant. Scalebar som vises i det opprinnelige eksemplet (dag 0), representerer 200 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokollen som presenteres her for profilering av brusk vev omsetning i storfe brusk explants kan brukes til karakteriserer behandling effekter av mange typer narkotika, inkludert hemmere av inflammatoriske intracellulære trasé, hemmere av proteolytiske enzymer, eller anabole vekstfaktorer.
To forskjellige oppsett ble beskrevet i denne protokollen: en anabole oppsett der explants ble stimulert med insulin-lignende vekstfaktor 1 (IGF-1), og en katabolske oppsett bestående stimulering med TNF-Alpha og Oncostatin M, der vev omsetning kan være hemmet ved hjelp av en bredspektret MMP-hemmer. Den viktigste produksjonen i denne metoden er kvantifisering av neo-epitope biomarkører direkte i betinget medium, som høstes gjennom hele kulturen perioden. Flere biomarkører kan måles i supernatanten, slik at for samtidig profilering av ulike katabolske og anabole prosesser i samme prøve. Histologiske farging med Safranin O/fast Green ble brukt til å validere funnene fra biomarkør analyse. Oncostatin M, TNF-Alpha, og IGF-1 ble brukt til å beskrive protokollen; metoden er imidlertid ikke begrenset til bestemte cytokin stimulatorer, og disse kan enkelt byttes mot andre, avhengig av hypotesen eller test behandlingen.
Tolkning av biomarkør produksjon er en timelig øvelse på grunn av de dynamiske endringene i chondrocyte funksjon og uttrykks profiler med anabole eller katabolske stimulering over tid. I ubehandlet explants, type II kollagen formasjon målt ved biomarkør ProC2 raskt avtar i løpet av de første 7-10 dager. Stimulering med IGF-1 eller lignende vekstfaktorer opprettholder ProC2 utgivelse i betinget medium på et nivå som kan sammenlignes med Baseline; Dermed er nedgangen mer gradvis, og utgivelsen er økt i forhold til ubehandlet explants. I et katabolske oppsett, Pro-inflammatorisk cytokiner indusere økt uttrykk for proteaser av chondrocyte i dager 0-14; Dette består hovedsakelig av aggrecanases. Dette fører til en innledende stor økning i aggrecanase-avledede protein fragmenter, inkludert AGNx1. På de senere stadier av kultur, chondrocytes uttrykke mer MMPs, som driver utgivelsen av MMP-genererte markører, for eksempel C2M, rundt dag 14 og framover. Således, for å profil effekten av en behandling, er det viktig å måle biomarkører i riktig tidsintervall.
Som beskrevet, behandling med inflammatoriske cytokiner som O + T cocktail vil føre brusk vev fornedrelse over tid. Den totale pool av ECM er begrenset av explant størrelse og bør vurderes ved analyse av biomarkør profil. Følgelig, etter den første økningen i biomarkør utgivelse, kan nivåene reduseres med tiden bare på grunn av reduksjonen i det resterende beløpet av explant ECM.
Tidligere ble OA først og fremst betraktet som en sykdom i ledd brusk. Men nyere studier tyder på at OA bør sees på som en sykdom i hele joint, der tidlig sykdom-relaterte endringer i den enkelte felles rom, synovium, bein, og brusk, forekommer parallelt, og over tid resultere i felles svikt12 ,21. Det er derfor viktig å erkjenne at i denne modellen systemet, er brusk isolert fra resten av felles (og organisme), begrense påvirkning av vev interaksjon effekter og systemiske faktorer som kan regulere homeostase av vevet. I stedet er det en forenklet enkelt vev kultur der eksperimentelt kontrollerte forhold kan være modulert å oppdage patologiske eller interventional endringer i vevet ved hjelp av biokjemiske teknikker, biomarkører, eller histologiske visualisering. På grunn av arkitekturen av brusk, variasjon i celle nummer, matrise sammensetning, og mengde variasjon er forventet både mellom explants og mellom vev kilder. Fordi den relative størrelsen av biomarkør output kan være forskjellig mellom eksperimenter, anbefales det å normalisere datasett for bedre sammenligning.
For å sikre minst mulig variasjon og best resultat, er det viktig å bruke brusk fra knærne som er så fersk som mulig, fortrinnsvis mellom 1 og 24 timer etter butchering. Isolering av brusk vev bør gjøres på en homogen måte med explants være omtrent samme tykkelse. Explants bør isoleres fra områder av tykk brusk, unngå områder nærmest midten. Vevet bør alltid være fuktig for å unngå celle død og matrise nedbryting. Lengden på eksperimentet3, tiden mellom middels endringer, timing av cytokin stimulering, og behandlingsintervaller kan justeres for å passe den hypotetisk gjennomsnitt modus for handling av den enkelte sammensatte eller mekanisme.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
CST, ACBJ og MK er ansatte i Nordic Bioscience. ACBJ og MK innehar aksjer i Nordic Bioscience. De resterende forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne takker det tekniske personalet ved Nordic Bioscience for laboratorie støtte, så vel som dansk forskningsstiftelse for generell støtte til forskningen vår.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 45% Iron(III) chloride solution | Sigma-Aldrich | 12322 | |
| Acetic acid | Merck | 1.00056.2500 | |
| Alamar Blue | Life tech Invitrogen | DAL1100 | |
| Biopsy processing cassettes – green | IHCWORLD | BC-0109G | |
| Biopsy punch W/Plunger (3 mm) | Scandidat | MTP-33-32 | |
| Bovine cartilage (Bovine knees) | Local slaughterhouse | ||
| C2M | Nordic Bioscience | Fee for service | |
| Corning 96-well plate | Sigma-Aldrich | CLS7007 | |
| Cover Glass Ø 13 mm | VWR | 631-0150P | |
| DMEM/F12-GlutaMAX Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12) without HEPES | Gibco | 31331-028 | |
| Ethanol ≥96% | VWR | 83804.36 | |
| Ethanol absolute ≥99.5% | VWR | 83813.36 | |
| exAGNx1 | Nordic Bioscience | Fee for service | |
| exPRO-C2 | Nordic Bioscience | Fee for service | |
| Fast green | Sigma-Aldrich | F7252 | |
| Formaldehyde solution 4% | Merck | 1004965000 | |
| GM6001 | Sigma-Aldrich | M5939-5MG | |
| Hematoxylin | Sigma-Aldrich | H3136 | |
| Hydrochloric acid | Merck | 30721-M | |
| IGF-1 | Sigma-Aldrich | I3769-50UG | |
| Oncostatin M | Sigma-Aldrich | O9635-10UG | |
| Penicillin-streptomycin (P/S) | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| Pertex (mounting medium for light microscopy) | HistoLab | 811 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Safranin O | Sigma-Aldrich | S2255 | |
| Sterile Standard Scalpels | Integra Miltex | 12-460-451 | |
| Sulfuric acid | Sigma-Aldrich | 30743 | |
| SUPERFROST PLUS Adhesion Microscope Slides | Thermo scientific | J1800AMNT | |
| TNF-alpha | R&D Systems | 210-TA-100 | |
| Toluene | Merck | 1.08327.2500 | |
| Vacuum Filtration "rapid"-Filtermax | TPP | 99955 |
References
- Cope, P. J., Ourradi, K., Li, Y., Sharif, M. Models of osteoarthritis: the good, the bad and the promising. Osteoarthritis and Cartilage. 27 (2), 230-239 (2018).
- Thysen, S., Luyten, F. P., Lories, R. J. U. Targets, models and challenges in osteoarthritis research. Disease Models & Mechanisms. 8 (1), 17-30 (2015).
- Reker, D., et al. Articular cartilage from osteoarthritis patients shows extracellular matrix remodeling over the course of treatment with sprifermin (recombinant human fibroblast growth factor 18). Osteoarthritis and Cartilage. 26, S43 (2018).
- Kjelgaard-Petersen, C., et al. Synovitis biomarkers: ex vivo characterization of three biomarkers for identification of inflammatory osteoarthritis. Biomarkers. 20 (8), 547-556 (2015).
- Henriksen, K., et al. A specific subtype of osteoclasts secretes factors inducing nodule formation by osteoblasts. Bone. 51 (3), 353-361 (2012).
- Gigout, A., et al. Sprifermin (rhFGF18) enables proliferation of chondrocytes producing a hyaline cartilage matrix. Osteoarthritis and Cartilage. 25 (11), 1858-1867 (2017).
- Reker, D., et al. Sprifermin (rhFGF18) modulates extracellular matrix turnover in cartilage explants ex vivo. Journal of Translational Medicine. 15 (1), 3560 (2017).
- Karsdal, M. A. Introduction. Biochemistry of Collagens, Laminins and Elastin. , Academic Press. New York. (2016).
- Heinegård, D., Saxne, T. The role of the cartilage matrix in osteoarthritis. Nature Reviews Rheumatology. 7 (1), 50-56 (2011).
- Karsdal, M. A., et al. Osteoarthritis– a case for personalized health care? Osteoarthritis and Cartilage. 22 (1), 7-16 (2014).
- Karsdal, M. A., Bay-Jensen, A. C., Henriksen, K., Christiansen, C. The pathogenesis of osteoarthritis involves bone, cartilage and synovial inflammation: may estrogen be a magic bullet? Menopause International. 18 (4), 139-146 (2012).
- Loeser, R. F., Goldring, S. R., Scanzello, C. R., Goldring, M. B. Osteoarthritis: a disease of the joint as an organ. Arthritis and Rheumatism. 64 (6), 1697-1707 (2012).
- Goldring, M. B., Goldring, S. R.
- Karsdal, M. A., et al. The coupling of bone and cartilage turnover in osteoarthritis: opportunities for bone antiresorptives and anabolics as potential treatments? Annals of the Rheumatic Diseases. 73 (2), 336-348 (2014).
- Genovese, F., Karsdal, M. A. Protein degradation fragments as diagnostic and prognostic biomarkers of connective tissue diseases: understanding the extracellular matrix message and implication for current and future serological biomarkers. Expert Review of Proteomics. 13 (2), 213-225 (2016).
- Gudmann, N. S., et al. Cartilage turnover reflected by metabolic processing of type II collagen: a novel marker of anabolic function in chondrocytes. International Journal of Molecular Sciences. 15 (10), 18789-18803 (2014).
- Madej, W., van Caam, A., Davidson, E. B., Buma, P., van der Kraan, P. M. Unloading results in rapid loss of TGFβ signaling in articular cartilage: role of loading-induced TGFβ signaling in maintenance of articular chondrocyte phenotype? Osteoarthritis and Cartilage. 24 (10), 1807-1815 (2016).
- Kjelgaard-Petersen, C. F., et al. Translational biomarkers and ex vivo models of joint tissues as a tool for drug development in rheumatoid arthritis. Arthritis & Rheumatology. 70 (9), 1419-1428 (2018).
- Wang, B., et al. Suppression of MMP activity in bovine cartilage explants cultures has little if any effect on the release of aggrecanase-derived aggrecan fragments. BMC Research Notes. 2 (4), 259 (2009).
- Bay-Jensen, A. C., et al. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISAs) for metalloproteinase derived type II collagen neoepitope, CIIM—Increased serum CIIM in subjects with severe radiographic osteoarthritis. Clinical Biochemistry. 44 (5-6), 423-429 (2011).
- Lories, R. J., Luyten, F. P.
