Klargøring og anvendelse af en ny bakteriel biosensor til formodet påvisning af skud rester

Summary

En protokol er præsenteret ved hjælp af syntetisk biologi teknikker til at syntetisere et sæt af bakterielle biosensorer til analyse af skudsår rester, og til at teste funktionen af anordningerne til deres tilsigtede anvendelse ved fluorescens spektroskopi.

Abstract

MicRoboCop er en biosensor, der er designet til en unik anvendelse i retsmedicinsk kemi. MicRoboCop er et system, der består af tre enheder, der, når de anvendes sammen, kan indikere tilstedeværelsen af skud rester (GSR) ved at fremstille et fluorescens signal ved tilstedeværelse af tre vigtige analysander (antimon, bly og organiske komponenter i GSR). Protokollen beskriver syntesen af de biosensorer, der anvender Escherichia coli (E. coli), og de analytiske kemi metoder, der anvendes til at vurdere Sensorernes selektivitet og følsomhed. Systemets funktion påvises ved hjælp af GSR, der er indsamlet fra indersiden af et brugt patronhylster. Når Biosensorerne er forberedt, kan de opbevares, indtil de er nødvendige, og kan bruges som test for disse vigtige analyter. En positiv respons fra alle tre analysander giver en formodet positiv test for GSR, mens hver enkelt anordning har applikationer til påvisning af analysander i andre prøver (f. eks. en detektor til blyforurening i drikkevand). Den vigtigste begrænsning af systemet er den tid, der kræves for et positivt signal; fremtidige arbejde kan indebære at studere forskellige organismer for at optimere responstid.

Introduction

En biosensor er enhver analytisk anordning, der anvender biologiske komponenter (såsom proteiner, nukleinsyrer eller hele organismer), der producerer et respons, der kan anvendes til påvisning af et kemisk stof eller analysand. F. eks. brugte kulmineindustrien en biosensor i meget af det 20. århundrede til at påvise tilstedeværelsen af giftige minegasser: Kanarieøerne i kulminen¹. Den biologiske organismes (kanarieøens) respons (død eller angst) over for en kemisk analysand (carbonmonoxid) blev observeret af minearbejderne for at beskytte arbejderne. I et mere moderne og sofistikeret eksempel kan bakterier ændres ved hjælp af syntetisk biologi teknikker til at reagere på tilstedeværelsen af en bestemt kemisk analysand ved at udstille en specifik respons, såsom ekspression af et fluorescerende protein.

Syntetisk biologi er et bredt begreb, der refererer til konstruktionen af biologiske enheder og systemer, der ikke eksisterer naturligt, eller re-design af eksisterende biologiske systemer til et bestemt formål². Syntetisk biologi skelnes fra genteknologi ved en standardmetode og eksistensen af standardiserede dele (standard syntetiske biologi genetiske elementer), der kan bruges til at syntetisere enheder og systemer. En del indføres i genomet af en anordning, en organisme som en bakterie, at udtrykke en bestemt egenskab, der vil tjene som en indikation af funktion. For eksempel, i mange syntetiske enheder, er udtrykket af et fluorescerende protein indført i en enkelt encellede organisme som en reporter protein. Flere enheder kan kombineres til et system. Genomer af mikroorganismer som bakterier er nemme at manipulere på denne måde. Talrige eksempler på biosensorer, der er specifikke for en lang række kemiske analyter, er blevet rapporteret i litteraturen i løbet af det sidste årti,^3,4.

I dette arbejde, er MicRoboCop systemet præsenteret som et eksempel på en biosensor designet ved hjælp af syntetisk biologi teknikker med nye anvendelser i retsmedicinsk og miljømæssig kemi. MicRoboCop er et system af tre separate enheder, der, når de kombineres, vil gøre det muligt for Escherichia coli at udtrykke rødt fluorescerende protein (RFP) i tilstedeværelse af skud rester (GSR), der er blevet indsamlet fra en persons hænder eller en overflade. Hver af de tre enheder reagerer på en specifik kemisk analysand, der vides at være en bestanddel af GSR⁵. De tre analysander, som systemet reagerer på, er I. 2, 4, 6-trinitrotoluen (TNT) og beslægtede stoffer, II. bly (i form af bly ioner) og III. antimon (også i form af ioner).

GSR består af mange forskellige kemiske stoffer, men de tre bruges sædvanligvis til at identificere en rest, da GSR er barium, bly og antimon⁵. Den standard bevismæssige test til identifikation af GSR er at bruge scanning elektronmikroskopi (SEM) med energi udbredt røntgen fluorescens (EDX)⁵. SEM-EDX gør det muligt for analytikere at identificere de unikke morfologi og elementært komponenter i GSR. I øjeblikket er der kun få udbredte binære formodede tests til rådighed. En nylig offentliggjort formodede test bruger ion-Mobility spektroskopi (IMS), som er specialiseret udstyr, der måske ikke er tilgængelige i mange laboratorier⁶. Der er også et par farve “spot” tests, der kan anvendes, selv om de typisk anvendes til distance bestemmelse eller til GSR identifikation på kuglehuller og sår⁵. Derudover har der været en vis begrænset opmærksomhed i litteraturen til elektrokemiske tests for GSR, der anvender voltammetrisk analyse, som har den fordel, at de potentielt er felt bærbare, eller anodisk stripping voltammetry, som er en ekstremt følsom metode for metalliske elementer⁷. Der er meget lidt omtale i litteraturen af biosensorer designet specielt med henblik på at afsløre GSR, selv om nogle biosensorer til andre retsmedicinske applikationer er blevet offentliggjort⁸.

De biologiske elementer for hver anordning i MicRoboCop-systemet og plasmid-konstruktionen er illustreret i figur 1. Den buede pil i figur 1b repræsenterer den promotor region, der er aktiveret i nærværelse af analysand, den ovale er den ribosomale bindingssted, der tillader oversættelse af reporter protein, den grå boks mærket RFP er det gen, der udtrykker rødt fluorescerende protein, og den røde Oktagon er transkription termineringstedet. Alle tre enheder vil blive brugt sammen som et system til at detektere GSR. Hver enhed med en bestemt promotor (SbRFP, PbRFP og TNT-RFP) vil blive inkueret med den prøve, der testes, og fluorescens af RFP vil blive målt. RFP udtrykkes kun, hvis den relevante kemiske analysand er til stede og aktiverer initiativtageren. Tre enheder, der reagerer på nogle af de kemiske stoffer til stede i GSR er designet og præsenteres i dette arbejde.

De projektledere, der anvendes i de tre mikrobocop-enheder, er en arsen-og antimon følsom promotor, sbrfp^9,10, en ledende følsom promotor, pbrfp^11,12 og en TNT-følsom promotor. TNT-RFP ¹³. da en søgning i litteraturen afslørede, at der ikke var nogen promotor til at reagere på barium, blev TNT-promotoren valgt i stedet, da denne promotor er følsom over for en række strukturelt beslægtede forbindelser (især 2,4-dinitrotoluen og dinitrobenzen), som vides at være en del af de organiske forbindelser, der efterlades i GSR. Denne promotor er blevet brugt til specifikt at detektere minut mængderne af TNT og 2,4-dinitrotoluen (2,4-DNT) i begravede landminer¹³. Ved hjælp af de tre enheder sammen som et system, vil en positiv test for GSR producere fluorescens i alle tre enheder. Et fluorescens signal i kun én eller to enheder vil indikere en anden miljø kilde for analysand eller for TNT-promotoren, aktivering af en forbindelse, der ikke er en organisk forbindelse efterladt i GSR. Ved at bruge alle tre enheder sammen minimeres muligheden for falsk positive resultater på grund af miljømæssige kilder. Blyfri ammunition, der vinder i popularitet, udgør stadig kun ca. 5% af ammunitions salget i USA. Derfor kan falsk negative resultater på grund af fravær af bly være en mulighed, men der er stadig nytte i en sensor, der bruger bly som markør for GSR¹⁴. Ud over denne specifikke retsmedicinske anvendelse, kan hver anordning anvendes separat med henblik på påvisning af miljøforurenende stoffer.

De præsenterede protokoller omfatter syntetiske biologi teknikker, der anvendes til at skabe de anordninger (sensor bakterier) og de analytiske teknikker til at kontrollere funktionen af enhederne og analysere fluorescens signaler opnået. Protokollen omfatter også indsamling af retsmedicinske beviser i form af hånd aftørring at indsamle GSR fra hænderne på en mistænkt eller svaber prøven omfatter at indsamle GSR fra en overflade. Resultater fra bly Sensorenheden præsenteres som eksempelresultater, sammen med en demonstration af en positiv test for GSR ved hjælp af en brugt patron kabinet.

Protocol

Bemærk: syntesen af E. coli , der udtrykker RFP, præsenteres. 1. fremstilling af plasmid-DNA fra E. coli Tø e. coli indeholder et plasmid med et RFP-gen-og ampicillin-resistens-gen og dyrker e. coli på Luria Broth (lb) agar-plader, der indeholder 100 μg/ml ampicillin ved 37 °c i 24 timer. For eksempel skal du bruge J10060 plasmid fra registret over standard biologiske dele, der anvendes til syntetisk biologi (Se tabel over materialer<…

Representative Results

Fluorescens spektre for den RFP-variant, der anvendes i dette arbejde, er vist i figur 2. Disse data er fra PbRFP-enheden, da den reagerer på bly og TNT-RFP-enheden, da den reagerer på to analyter, 2,4-DNT og 1, 3-DNB. Dette tal viser spektret af en negativ kontrol (ingen analysand tilsat), og spektrene på to forskellige niveauer af analysand tilsættes. Det maksimale fluorescens signal for den anvendte RFP-variant blev observeret ved 575 nm (excitations bølgelængde …

Discussion

Ændringer og fejlfinding

Det i tabel 4 beskrevne eksperiment kan på enhver måde ændres, så det passer til de sensorer, der er konstrueret. Det vigtigste aspekt af en kemisk sensor er at vurdere dens følsomhed og specificitet. Det er gavnligt at sikre, at en lang række koncentrationer af analytten analyseres for at bestemme sensorens nyttige analytiske område. Det er også værd at fastsætte et maksimum niveau af analysand for cellerne. Da de analysand…

Materials

1,3-dinitrobenzene, 97%	Aldrich	D194255-25G
2,4-dinitrotoluene, 97%	Aldrich	101397-5G
Agar	Fisher Scientific	BP1423-500
Ampicillin	Fisher Scientific	BP1760-5
Antimony, Reference Standard Solution (1000ppm ±1%/Certified)	Fisher Scientific	SA450-100	Standard in dilute HNO3
Cut Smart Buffer	New England BioLabs	B7204S
Duplex Buffer	Integrated DNA Technologies	11-01-03-00
EcoRI-HF Restriction Enzyme	New England BioLabs	R3101S
Ethanol, HPLC grade, denatured	Acros Organics	AC611050040	Solvents do not need to be HPLC grade, ACS or reagent grade will work.
Eurofins Genomics SimpleSeq DNA Sequencing Kits	Eurofins Genomics	SimpleSeq Kit Standard
Forward primer for colony PCR	Integrated DNA Technologies		5’- GCCGCTTGAATTCGTCATATAT-3’
Forward primer for DNA sequencing	Integrated DNA Technologies		5’- GTAAAACGACGGCCAGTG-3’
IBI Science High Speed Plasmid Mini-kit	IBI Scientific	IB47101
LB Broth, Miller	Fisher Scientific	BP1426-500
Lead, Reference Standard Solution (1000ppm ±1%/Certified)	Fisher Scientific	SL21-100	Standard in dilute HNO3
LeadOff Disposable Cleaning and Decon Wipes	Hygenall	45NRCN	Sold in canisters or individually wrapped, any alcohol based wipe will work.
Methanol, HPLC grade	Fisher Scientific	A452-4	Solvents do not need to be HPLC grade, ACS or reagent grade will work.
NEB 5-alpha Competent E. coli cells	New England BioLabs	C2987I
NheI-HF Restriction Enzyme	New England BioLabs	R3131S
Nuclease free water	New England BioLabs	B1500S
OneTaq 2X Master Mix with Standard Buffer	New England BioLabs	M0482S
Plasmids from the registry of standard biological parts used for synthetic biology	Registry of Standard Biological Parts		http://parts.igem.org/Main_Page
Promoter Sequences	Integrated DNA Technologies		Sb promoter: 5’-GCATGAATTCAGTCAT ATATGTTTTTGACTTATCCGCTTCGAAGAGAG AGACACTACCTGCAACAATCGCTAGCGCAT-3’ 3’-CGTACTTAAGCTCACTATATACAAAAACT GAATAGGCGAAGCTTCTCTCTCTGTGATGGAC GTTGTTAGCGATCGCGTA-5’ Pb promoter: 5’-GCATGAATTCGTCTTG ACTCTATAGTAACTAAGGGTGTATAATCGGCA ACGCGAGCTAGCGCAT-3’ 3’-CGTACTTAAGCAGAACTGAGATATCATTG ATCTCCCACATCTTAGCCGTTGCGCTGCGATCGCGTA-5’ TNT promoter: 5’GCATTCTAGATCAATT TATTTGAACAAGGCGGTCAATTCTCTTCGATT TTATCTCTCGTAAAAAAACGTGATACTCATCA CATCGACGAAACAACGTCACTTATACAAAAAT CACCTGCGAGAGATTAATTGAATTCGCAT3’ 3’CGTAAGATCTAGTTAAATAAACTTGTTCCG CCAGTTAAGAGAAGCTAAAATAGAGAGCATTT TTTTGCACTATGAGTAGTGTAGCTGCTTTGTT GCAGTGAATATGTTTTTAGTGGACGCTCTCTA ATTAACTTAAGCGTA5’
Reverse primer for colony PCR	Integrated DNA Technologies		5’- GCCGCTTGAATTCGTCTAGACT- 3’
Reverse primer for DNA sequencing	Integrated DNA Technologies		5’- GGAAACAGCTATGACCATG-3’
T4 DNA Ligase	New England BioLabs	M0202S