一种用于射击残留量推定检测的新型细菌生物传感器的研制与应用
Summary
提出了一种利用合成生物学技术合成一套细菌生物传感器来分析枪弹残留物的方案, 并利用荧光光谱法测试这些器件的预期用途的功能。
Abstract
Microbcop 是一种生物传感器, 专为法医化学中的独特应用而设计。Microbcop 是一个由三个器件组成的系统, 当一起使用时, 可以通过在存在三种关键分析物 (锑、铅和 gsr 的有机成分) 的情况下产生荧光信号来指示枪弹残留物 (GSR) 的存在。该协议描述了使用大肠杆菌(大肠杆菌) 合成生物传感器的方法, 以及用于评估传感器选择性和灵敏度的分析化学方法。该系统的功能是通过使用从废墨盒外壳内部收集的 GSR 来证明的。一旦准备好, 生物传感器就可以储存到需要, 并可以作为这些关键分析物的测试。所有三种分析物的阳性反应为 GSR 提供了推定阳性测试, 而每个设备都有检测其他样品中的分析物的应用 (例如, 饮用水中铅污染检测器)。系统的主要限制是正信号所需的时间;未来的工作可能涉及研究不同的生物体, 以优化反应时间。
Introduction
生物传感器是指使用生物成分 (如蛋白质、核酸或整个生物体) 产生可用于检测化学物质或分析物的反应的任何分析装置。例如, 在20世纪的大部分时间里, 煤矿业都使用生物传感器来检测有毒矿井气体的存在: 煤矿1中的金丝雀。矿工们观察到生物生物 (金丝雀) 对化学分析物 (一氧化碳) 的反应 (死亡或痛苦), 以保护工人。在一个更现代和复杂的例子中, 细菌可以使用合成生物学技术通过显示特定的反应 (如荧光蛋白的表达) 来改变某些化学分析物的存在。
合成生物学是一个宽泛的术语, 指的是构建不自然存在的生物装置和系统, 或为特定目的重新设计现有的生物系统2。合成生物学是通过标准方法与基因工程区分开来的, 并存在可用于合成设备和系统的标准化部件(标准合成生物学遗传元素)。一个部分被引入到一个装置的基因组中, 一个生物, 如细菌, 以表达某种特征, 作为功能的指示。例如, 在许多合成设备中, 荧光蛋白的表达作为报告蛋白被引入单个细胞生物体。多个设备可以组合到一个系统中。细菌等微生物的基因组很容易以这种方式操作。在过去十年的文献中, 文献中报道了许多针对各种化学分析物的生物传感器的例子。
在这项工作中, 米机器人警察系统是一个生物传感器设计的合成生物学软件的例子, 在法医和环境化学中的新应用。Microbcop 是一个由三个独立的设备组成的系统, 当结合在一起时, 将允许大肠杆菌在从一个人的手或表面收集到的枪弹残留物 (gsr) 的情况下表达红色荧光蛋白 (RFP)。这三个器件中的每一个都对已知为 GSR5成分的特定化学分析物做出响应。系统响应的三种分析物为 I. 2、4、6-三硝基甲苯 (TNT) 及相关化合物, II。铅 (以铅离子的形式), 和 III。锑 (也以离子的形式)。
GSR 由许多不同的化学物质组成, 但通常用于鉴定残渣的三种物质是钡、铅和锑5。GSR 鉴定的标准证据测试是使用具有能量色散 x 射线荧光 (EDX) 5 的扫描电子显微镜 (SEM).Sem edx 使分析师能够识别 GSR 的独特形态和元素成分。目前, 有很少广泛使用的二元推定测试可用。最近公布的一项推定测试使用离子-流动性光谱仪 (IMS), 这是许多实验室可能无法使用的专用设备。也有一些颜色的 “斑点” 测试可以使用, 虽然他们通常用于距离确定或 GSR 识别弹孔和伤口5。此外, 文献中对使用伏安分析的 GSR 电化学测试的关注有限, 该测试具有可能具有现场便携式或阳极剥离伏安法的优点, 这是一种极具实用性的方法。对金属元素的敏感方法7。在专门为检测 GSR 而设计的生物传感器的文献中, 很少提及, 尽管已经出版了一些用于其他法医应用的生物传感器.
M工商科普系统中每个装置的生物元素以及质粒结构如图 1所示。图 1b中的弯曲箭头表示在分析物存在下激活的启动子区域, 椭圆形是允许翻译报告人蛋白质的核糖体结合位点, 标记为 rfp 的灰色框是表达红色的基因荧光蛋白和红色八角形是转录终止位点。这三种设备都将作为检测 GSR 的系统一起使用。每个具有特定启动子 (SbRFP、PbRFP 和 TNT-RFP) 的设备都将与正在测试的样本一起孵育, 并测量 RFP 的荧光。只有在存在适当的化学分析物并激活启动子区域的情况下, 才会表达 RFP。设计了三个对 GSR 中存在的一些化学物质做出反应的装置, 并在这项工作中介绍了这些装置。
三个 microbcop 装置中使用的促进剂是砷和锑敏感启动子sbrfp9,10、铅敏感启动子、pbrfp11、12和 tnt 敏感启动子,TNT-RFP13. 由于文献中的搜索显示, 没有旨在对钡做出反应的启动子, 因此选择了 tnt 启动子, 因为该启动子对一些结构相关的化合物 (特别是 2, 4-二硝基甲苯和是 GSR 中留下的有机化合物的一部分。该启动子已成功地用于专门检测埋地地雷13中 TNT 和 2, 4-dinitlutolene (2, 4-DNT) 的微量。将这三个器件作为一个系统结合使用, GSR 的阳性测试将在所有三个器件中产生荧光。只有一个或两个器件中的荧光信号将表明分析物的另一个环境来源, 或者在 TNT 启动子的情况下, 由不是 GSR 中留下的有机化合物的化合物激活。通过同时使用这三种设备, 最大限度地减少了由于环境来源而产生假阳性结果的可能性。无铅弹药越来越受欢迎, 在美国仍然只占弹药销售的5% 左右;因此, 由于缺乏铅而产生的假阴性结果可能是有可能的, 但在使用铅作为 GSR14 标记的传感器中仍然有用。除了这种特定的法医应用外, 每个设备还可以单独用于检测环境污染物。
所提出的协议包括用于创建器件的合成生物学技术 (传感器细菌) 和用于检查设备功能和分析所获得的荧光信号的分析技术。该议定书还包括以手擦的形式收集法医证据, 从嫌疑人手中收集 GSR, 或擦拭从表面收集 GSR。铅传感器装置的结果作为示例结果, 并演示了使用乏墨盒外壳对 GSR 进行的阳性测试。
Protocol
Representative Results
Discussion
修改和故障排除
表 4中描述的实验可以以任何适合已设计传感器的方式进行修改。化学传感器最重要的方面是评估其灵敏度和特异性。这是有益的, 以确保广泛的浓度分析分析, 以确定有用的分析范围的传感器。确定细胞的最大分析物水平也是值得的。由于本研究中使用的分析物是有毒金属 (Pb 和 Sb) 或甲醇溶液中的有机化合物 (用于 TNT 衍生物), 因此?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
作者希望向 BIOL 324 (遗传学) 的 Longwood 大学的学生和 CHEM 403 (高级化学实验室问题解决) 中参与锑和铅生物传感器初步制备和测试的学生表示感谢。MicRoboCop 的想法是在 GCAT SynBIO 研讨会 (2014年夏季) 上提出的, 该讲习班由 NSF 和 Howard Hughes 医学院资助, 马里兰州巴尔的摩县大学主办。作者还感谢龙伍德大学的 Cook-coe 艺术与科学学院和 GCAT SynBio 校友赠款公司提供的资金。
Materials
| 1,3-dinitrobenzene, 97% | Aldrich | D194255-25G | |
| 2,4-dinitrotoluene, 97% | Aldrich | 101397-5G | |
| Agar | Fisher Scientific | BP1423-500 | |
| Ampicillin | Fisher Scientific | BP1760-5 | |
| Antimony, Reference Standard Solution (1000ppm ±1%/Certified) | Fisher Scientific | SA450-100 | Standard in dilute HNO3 |
| Cut Smart Buffer | New England BioLabs | B7204S | |
| Duplex Buffer | Integrated DNA Technologies | 11-01-03-00 | |
| EcoRI-HF Restriction Enzyme | New England BioLabs | R3101S | |
| Ethanol, HPLC grade, denatured | Acros Organics | AC611050040 | Solvents do not need to be HPLC grade, ACS or reagent grade will work. |
| Eurofins Genomics SimpleSeq DNA Sequencing Kits | Eurofins Genomics | SimpleSeq Kit Standard | |
| Forward primer for colony PCR | Integrated DNA Technologies | 5’- GCCGCTTGAATTCGTCATATAT-3’ | |
| Forward primer for DNA sequencing | Integrated DNA Technologies | 5’- GTAAAACGACGGCCAGTG-3’ | |
| IBI Science High Speed Plasmid Mini-kit | IBI Scientific | IB47101 | |
| LB Broth, Miller | Fisher Scientific | BP1426-500 | |
| Lead, Reference Standard Solution (1000ppm ±1%/Certified) | Fisher Scientific | SL21-100 | Standard in dilute HNO3 |
| LeadOff Disposable Cleaning and Decon Wipes | Hygenall | 45NRCN | Sold in canisters or individually wrapped, any alcohol based wipe will work. |
| Methanol, HPLC grade | Fisher Scientific | A452-4 | Solvents do not need to be HPLC grade, ACS or reagent grade will work. |
| NEB 5-alpha Competent E. coli cells | New England BioLabs | C2987I | |
| NheI-HF Restriction Enzyme | New England BioLabs | R3131S | |
| Nuclease free water | New England BioLabs | B1500S | |
| OneTaq 2X Master Mix with Standard Buffer | New England BioLabs | M0482S | |
| Plasmids from the registry of standard biological parts used for synthetic biology | Registry of Standard Biological Parts | http://parts.igem.org/Main_Page | |
| Promoter Sequences | Integrated DNA Technologies | Sb promoter: 5’-GCATGAATTCAGTCAT ATATGTTTTTGACTTATCCGCTTCGAAGAGAG AGACACTACCTGCAACAATCGCTAGCGCAT-3’ 3’-CGTACTTAAGCTCACTATATACAAAAACT GAATAGGCGAAGCTTCTCTCTCTGTGATGGAC GTTGTTAGCGATCGCGTA-5’ Pb promoter: 5’-GCATGAATTCGTCTTG ACTCTATAGTAACTAAGGGTGTATAATCGGCA ACGCGAGCTAGCGCAT-3’ 3’-CGTACTTAAGCAGAACTGAGATATCATTG ATCTCCCACATCTTAGCCGTTGCGCTGCGATCGCGTA-5’ TNT promoter: 5’GCATTCTAGATCAATT TATTTGAACAAGGCGGTCAATTCTCTTCGATT TTATCTCTCGTAAAAAAACGTGATACTCATCA CATCGACGAAACAACGTCACTTATACAAAAAT CACCTGCGAGAGATTAATTGAATTCGCAT3’ 3’CGTAAGATCTAGTTAAATAAACTTGTTCCG CCAGTTAAGAGAAGCTAAAATAGAGAGCATTT TTTTGCACTATGAGTAGTGTAGCTGCTTTGTT GCAGTGAATATGTTTTTAGTGGACGCTCTCTA ATTAACTTAAGCGTA5’ |
|
| Reverse primer for colony PCR | Integrated DNA Technologies | 5’- GCCGCTTGAATTCGTCTAGACT- 3’ | |
| Reverse primer for DNA sequencing | Integrated DNA Technologies | 5’- GGAAACAGCTATGACCATG-3’ | |
| T4 DNA Ligase | New England BioLabs | M0202S |
References
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