Utarbeidelse og anvendelse av en ny bakteriell Biosensor for presumptive deteksjon av skudd rester

Summary

En protokoll presenteres ved hjelp av syntetiske biologi teknikker for å syntetisere et sett av bakteriell biosensors for analyse av skudd rester, og for å teste funksjon av enhetene for tiltenkt bruk ved hjelp av fluorescens spektroskopi.

Abstract

MicRoboCop er en Biosensor som er designet for en unik anvendelse innen rettsmedisinske kjemi. MicRoboCop er et system bestående av tre enheter som, når de brukes sammen, kan indikere tilstedeværelsen av skudd rester (GSR) ved å produsere et fluorescens signal i nærvær av tre viktige analytter (antimon, bly, og organiske komponenter av GSR). Protokollen beskriver syntesen av biosensors ved hjelp av Escherichia coli (E. coli), og de analytiske kjemi metodene som brukes til å evaluere selektivitet og følsomheten til sensorene. Funksjonen til systemet er demonstrert ved hjelp av GSR innhentet fra innsiden av en brukt patron casing. En gang forberedt, det biosensors kan lagret til behøvde og kan brukes som test for disse nøkkel analytter. En positiv respons fra alle tre analytter gir en Presumptive positiv test for GSR, mens hver enkelt enhet har søknader om påvisning av analytter i andre prøver (f.eks. en detektor for bly forurensning i drikkevann). Den viktigste begrensningen av systemet er tiden det tar for et positivt signal; fremtidig arbeid kan innebære å studere forskjellige organismer for å optimalisere responstiden.

Introduction

En Biosensor er enhver analytisk enhet som bruker biologiske komponenter (som proteiner, nukleinsyre syrer, eller hele organismer) som produserer et svar som kan brukes for påvisning av en kjemisk substans eller analytt. Som et eksempel, kullgruveindustrien brukt en Biosensor for mye av de 20^th århundre for å oppdage tilstedeværelsen av giftige gruve gasser: kanarifuglen i kull gruven¹. Den biologiske organisme (Canary ‘ s) respons (død eller nød) til en kjemisk analytt (karbonmonoksid) ble observert av gruvearbeiderne for å beskytte arbeiderne. I et mer moderne og sofistikert eksempel, kan bakterier endres ved hjelp av syntetiske biologi teknikker for å svare på tilstedeværelsen av en viss kjemisk analytt ved å stille et bestemt svar, for eksempeluttrykk for et fluorescerende protein.

Syntetisk biologi er et bredt begrep som refererer til bygging av biologiske enheter og systemer som ikke eksisterer naturlig, eller re-design av eksisterende biologiske systemer for et bestemt formål². Syntetisk biologi skilles fra genetisk engineering av en standard metodikk og eksistensen av standardiserte deler (standard syntetisk biologi genetiske elementer) som kan brukes til å syntetisere enheter og systemer. En del er innført i Genova av en enhet, en organisme som en bakterie, for å uttrykke en viss egenskap som vil tjene som en indikasjon på funksjon. For eksempel, i mange syntetiske enheter, er uttrykket av et fluorescerende protein innført i en enkelt encellede organisme som reporter protein. Flere enheter kan kombineres til et system. Genomer av mikroorganismer som bakterier er lett å manipulere på denne måten. Mange eksempler på biosensors som er spesifikke for et bredt spekter av kjemiske analytter har blitt rapportert i litteraturen i løpet av det siste tiåret^3,4.

I dette arbeidet, MicRoboCop systemet er presentert som et eksempel på en Biosensor utformet ved hjelp av syntetiske biologi teknikker med romanen programmer i rettsmedisinske og miljøkjemi. MicRoboCop er et system av tre separate enheter som, kombinert, vil tillate Escherichia coli å uttrykke rødt fluorescerende PROTEIN (RFP) i nærvær av skudd rester (GSR) som er samlet inn fra en persons hender eller en overflate. Hver av de tre enhetene reagerer på en bestemt kjemisk analytt som er kjent for å være en komponent i GSR⁵. De tre analytter som systemet svarer er jeg. 2, 4, 6-trinitrotoluene (TNT) og relaterte forbindelser, II. bly (i form av bly ioner), og III. antimon (også i form av ioner).

GSR består av mange forskjellige kjemiske stoffer, men de tre som vanligvis brukes til å identifisere en rest som GSR er barium, bly, og antimon⁵. Standard bevismessige test for identifisering av GSR er å bruke skanning elektron mikroskopi (SEM) med energi dispersive X-ray fluorescens (EDX)⁵. SEM-EDX lar analytikere å identifisere den unike morfologi og elementær komponenter av GSR. For tiden er det få mye brukt binære presumptive tester tilgjengelig. En nylig publisert presumptive test bruker ion-Mobility spektroskopi (IMS), som er spesialisert utstyr som kanskje ikke er tilgjengelig i mange laboratorier⁶. Det er også noen farge “spot” tester som kan brukes, selv om de vanligvis brukes for avstand besluttsomhet eller for GSR identifikasjon på bullet hull og sår⁵. I tillegg har det vært en viss begrenset oppmerksomhet i litteraturen til elektrokjemiske tester for GSR som benytter voltammetric analyse, som har fordelen av potensielt være feltet bærbare, eller anodisk stripping voltammetri, som er en ekstremt følsom metode for metalliske elementer⁷. Det er svært lite omtale i litteraturen i biosensors designet spesielt for det formål å oppdage GSR, men noen biosensors for andre rettsmedisinske søknader har blitt publisert⁸.

De biologiske elementene for hver enhet i MicRoboCop-systemet, og plasmider konstruksjonen, er illustrert i figur 1. Den buede pilen i figur 1B representerer arrangøren regionen som er aktivert i nærvær av analytt, er den ovale ribosomal bindende nettsted som tillater oversettelse av reporteren protein, den grå boksen er merket RFP er genet som uttrykker rød fluorescerende protein, og den røde Octagon er transkripsjon oppsigelse området. Alle tre enhetene vil bli brukt sammen som et system for å oppdage GSR. Hver enhet med en bestemt promoter (SbRFP, PbRFP og TNT-RFP) vil bli inkubert med prøven som blir testet og fluorescens av RFP vil bli målt. RFP vil bare bli uttrykt hvis den aktuelle kjemiske analytt er til stede og aktiverer promoter regionen. Tre enheter som responderer på noen av de kjemiske stoffene som finnes i GSR, er utformet og presenteres i dette arbeidet.

Den arrangører som brukes i de tre MicRoboCop enhetene er en arsen og antimon følsom promoter, SbRFP, en bly følsom promoter, PbRFP^11,12 og en TNT følsom promoter, TNT-RFP ¹³. fordi et søk i litteraturen avslørte ingen promoter utformet for å svare på barium, ble TNT arrangøren valgt i stedet siden denne arrangøren er følsom for en rekke strukturelt relaterte forbindelser (særlig 2, 4-dinitrotoluene og dinitrobenzene) som er kjent for å være en del av de organiske forbindelsene etterlatt i GSR. Denne arrangøren har med hell blitt brukt til å spesifikt oppdage minutt mengder TNT og 2, 4-dinitrotoluene (2, 4-DNT) i begravd land gruver¹³. Ved å bruke de tre enhetene sammen som et system, vil en positiv test for GSR produsere fluorescens i alle tre enhetene. En fluorescens signal i bare én eller to enheter vil indikere en annen miljømessig kilde til analytt (e) eller i tilfelle av TNT arrangøren, aktivering av en forbindelse som ikke er en organisk sammensatt etterlatt i GSR. Ved å bruke alle tre enhetene sammen, er muligheten for et falskt positivt resultat på grunn av miljømessige kilder minimert. Blyfri ammunisjon, som er stadig i popularitet, representerer fortsatt bare ca 5% av ammunisjon salg i USA; Derfor, falske negative resultater på grunn av fravær av bly kan være en mulighet, men det er fortsatt verktøyet i en sensor som bruker bly som en markør for GSR¹⁴. I tillegg til dette spesifikke rettsmedisinske programmet, kan hver enhet brukes separat for å oppdage miljøgifter.

Protokollene som presenteres inkluderer syntetiske biologi teknikker som brukes til å lage enheter (sensor bakterier) og analytiske teknikker for å sjekke funksjonen til enhetene og analysere fluorescens signalene innhentet. Protokollen inkluderer også innsamling av rettsmedisinske bevis i form av hånden tørke for å samle GSR fra hendene på en mistenkt eller skure å samle GSR fra en overflate. Resultater fra bly sensor enheten presenteres som eksempel resultater, sammen med en demonstrasjon av en positiv test for GSR ved hjelp av en brukt patron casing.

Protocol

Merk: syntese av E. coli uttrykke RFP presenteres. 1. utarbeidelse av plasmider DNA fra E. coli Tin e. coli som inneholder en plasmider med et RFP-gen og Ampicillin motstands gen og Øk e. coli på Luria buljong (LB) agar plater som inneholder 100 μg/ml Ampicillin ved 37 ° c i 24 timer. Bruk for eksempel J10060-plasmider fra registeret av standard biologiske deler som brukes til syntetisk biologi (se tabell over materialer). J100…

Representative Results

Fluorescens Spectra for RFP-varianten som brukes i dette arbeidet, er vist i figur 2. Disse dataene er fra PbRFP enheten som den reagerer på bly og TNT-RFP enheten som den reagerer på to analytter, 2, 4-DNT og 1, 3-DNB. Denne illustrasjonen viser spekteret av en negativ kontroll (ingen analytt lagt til), og Spectra på to ulike nivåer av analytt lagt. Det maksimale fluorescens signalet for RFP-varianten som ble brukt ble observert ved 575 NM (eksitasjon bølgelengde 50…

Discussion

Modifikasjoner og feilsøking

Eksperimentet beskrevet i Tabell 4 kan endres på en hvilken som helst måte som passer til sensorene som er utformet. Det viktigste aspektet ved en kjemisk sensor er å evaluere sin følsomhet og spesifisitet. Det er fordelaktig å sikre at et bredt spekter av konsentrasjoner av analytt analyseres for å fastslå den nyttige analytiske rekkevidden til sensoren. Det er også verdt å bestemme et maksimalt nivå av analytt for cell…

Materials

1,3-dinitrobenzene, 97%	Aldrich	D194255-25G
2,4-dinitrotoluene, 97%	Aldrich	101397-5G
Agar	Fisher Scientific	BP1423-500
Ampicillin	Fisher Scientific	BP1760-5
Antimony, Reference Standard Solution (1000ppm ±1%/Certified)	Fisher Scientific	SA450-100	Standard in dilute HNO3
Cut Smart Buffer	New England BioLabs	B7204S
Duplex Buffer	Integrated DNA Technologies	11-01-03-00
EcoRI-HF Restriction Enzyme	New England BioLabs	R3101S
Ethanol, HPLC grade, denatured	Acros Organics	AC611050040	Solvents do not need to be HPLC grade, ACS or reagent grade will work.
Eurofins Genomics SimpleSeq DNA Sequencing Kits	Eurofins Genomics	SimpleSeq Kit Standard
Forward primer for colony PCR	Integrated DNA Technologies		5’- GCCGCTTGAATTCGTCATATAT-3’
Forward primer for DNA sequencing	Integrated DNA Technologies		5’- GTAAAACGACGGCCAGTG-3’
IBI Science High Speed Plasmid Mini-kit	IBI Scientific	IB47101
LB Broth, Miller	Fisher Scientific	BP1426-500
Lead, Reference Standard Solution (1000ppm ±1%/Certified)	Fisher Scientific	SL21-100	Standard in dilute HNO3
LeadOff Disposable Cleaning and Decon Wipes	Hygenall	45NRCN	Sold in canisters or individually wrapped, any alcohol based wipe will work.
Methanol, HPLC grade	Fisher Scientific	A452-4	Solvents do not need to be HPLC grade, ACS or reagent grade will work.
NEB 5-alpha Competent E. coli cells	New England BioLabs	C2987I
NheI-HF Restriction Enzyme	New England BioLabs	R3131S
Nuclease free water	New England BioLabs	B1500S
OneTaq 2X Master Mix with Standard Buffer	New England BioLabs	M0482S
Plasmids from the registry of standard biological parts used for synthetic biology	Registry of Standard Biological Parts		http://parts.igem.org/Main_Page
Promoter Sequences	Integrated DNA Technologies		Sb promoter: 5’-GCATGAATTCAGTCAT ATATGTTTTTGACTTATCCGCTTCGAAGAGAG AGACACTACCTGCAACAATCGCTAGCGCAT-3’ 3’-CGTACTTAAGCTCACTATATACAAAAACT GAATAGGCGAAGCTTCTCTCTCTGTGATGGAC GTTGTTAGCGATCGCGTA-5’ Pb promoter: 5’-GCATGAATTCGTCTTG ACTCTATAGTAACTAAGGGTGTATAATCGGCA ACGCGAGCTAGCGCAT-3’ 3’-CGTACTTAAGCAGAACTGAGATATCATTG ATCTCCCACATCTTAGCCGTTGCGCTGCGATCGCGTA-5’ TNT promoter: 5’GCATTCTAGATCAATT TATTTGAACAAGGCGGTCAATTCTCTTCGATT TTATCTCTCGTAAAAAAACGTGATACTCATCA CATCGACGAAACAACGTCACTTATACAAAAAT CACCTGCGAGAGATTAATTGAATTCGCAT3’ 3’CGTAAGATCTAGTTAAATAAACTTGTTCCG CCAGTTAAGAGAAGCTAAAATAGAGAGCATTT TTTTGCACTATGAGTAGTGTAGCTGCTTTGTT GCAGTGAATATGTTTTTAGTGGACGCTCTCTA ATTAACTTAAGCGTA5’
Reverse primer for colony PCR	Integrated DNA Technologies		5’- GCCGCTTGAATTCGTCTAGACT- 3’
Reverse primer for DNA sequencing	Integrated DNA Technologies		5’- GGAAACAGCTATGACCATG-3’
T4 DNA Ligase	New England BioLabs	M0202S