הקמה ואפיון של שלוש מנות העמידות Afatinib של ריאה אדנוקרצינומה PC-9 תאים שפותחו עם הגדלת מינונים של Afatinib
Summary
שיטה להקמת קווי ההתנגדות afatinib מ-ריאה אדנוקרצינומה PC-9 תאים פותחה, תאים עמידים היו מאופיין. התאים עמידים ניתן להשתמש כדי לחקור את הגידול באפידרמיס קולטן גורם טירולה קינאז מעכב-התנגדות מנגנונים, ישים עבור חולים עם סרטן ריאות תא לא קטן.
Abstract
התנגדות נרכש מעכבי היעד המולקולרי היא בעיה חמורה בטיפול בסרטן. סרטן ריאות נשאר הגורם המוביל למוות הקשור לסרטן ברוב המדינות. גילוי של “מוטציות מנהלי התקן אונגניים”, כגון קולטן באפידרמיס גורם גדילה (egfr)-הפעלת מוטציות, ובעקבות פיתוח של סוכנים ממוקדים מולקולריים של egfr טירוצין קינאז מעכבי (tkis) (gefitinib, ארסבה, הטיפול בסרטן ריאות שונה באופן דרמטי בעשורים האחרונים. עם זאת, תרופות אלה עדיין לא יעיל בחולים עם סרטן ריאות תא לא קטן (NSCLC) נושאת Egfr-הפעלת מוטציות. לאחר התנגדות נרכש, ההתקדמות מערכתית של NSCLC נשאר מכשול משמעותי בטיפול בחולים עם EGFR מוטציה חיובית NSCLC. כאן, אנו מציגים שיטת הסלמה מינון חורג להקמת שלושה עצמאיים afatinib שנרכשו קווי תאים מתוך nsclc PC-9 תאים מחסה egfr-הפעלת מוטציות של 15 בסיס זוג מחיקות ב egfr אקסון 19. שיטות לאפיון שלושת קווי הצינוק העצמאיים של afatinib מוצגים לזמן קצר. מנגנוני ההתנגדות הנרכשים ל-EGFR TKIs הם הטרוגנית. לכן, יש לבדוק קווי תאים מרובים עם עמידות בפני EGFR-TKIs. 10 עד 12 חודשים נדרשים להשיג קווי תאים עם התנגדות נרכש באמצעות הגישה הזאת הסלמה מינון חורג. הגילוי של מנגנוני ההתנגדות החדשניים יתרום לפיתוח אסטרטגיות טיפוליות יעילות ובטוחות יותר.
Introduction
חמש טירולך קינאז מעכבי, מיקוד קולטן באפידרמיס גורם הצמיחה (EGFR), כולל gefitinib, erlotinib, החוליה, דקאומוטיניב, ו osimertinib זמינים כרגע לטיפול בחולים עם מוטציה EGFR-חיובי התא לא קטן סרטן (NSCLC). במהלך העשור האחרון, טיפולים עבור חולים כאלה עברו התפתחות דרמטית עם התגלית של EGFR פוטנציאל חדש-TKIs. בין חולים עם אדנוקרצינומה ריאה, מוטציות סומתיות ב Egfr מזוהים כ 50% של אסיה ו 15% של החולים הקווקזי1. המוטציות הנפוצות ביותר ב-egfr הן מוטציה של L858R point ב-egfr אקסון 21 ו -15 בסיס זוג (bp) מחיקות ב-egfr אקסון 192. ב-EGFR מוטציה-חולים חיוביים עם NSCLC, EGFR-TKIs לשפר את שיעורי התגובה ואת התוצאות הקליניות בהשוואה לתקן הקודם של פלטינה כימותרפיה3.
Gefitinib ו טרסבה היו מעכבי המולקולה הראשונה קטנה ומכונים בדרך כלל egfr tkis הדור הראשון. אלה EGFR TKIs לחסום את פעילות טירוצין קינאז על ידי מתחרה עם ATP וכריכה הפיכה הפיך לאתרי כריכת ATP4. Afatinib הוא הדור השני EGFR TKI, כי מאוגד הפיך והרב נקשר לתחום טירוצין קינאז של EGFR והוא מאופיין מעכבי משפחה הפאן-אנושיים5.
למרות התועלת הרבה של טיפולים אלה בחולים עם NSCLC, התנגדות נרכש הוא בלתי נמנע. מנגנון ההתנגדות השכיח ביותר נגד הדור הראשון והשני של egfr tkis הוא הופעתה של המוטציה T790M ב-egfr אקסון 20, אשר קיים 50-70% של דגימות הגידול6,7,8. מנגנוני התנגדות אחרים כוללים אותות עוקפים (כדי MET, IGF1R, ו HER2), טרנספורמציה לסרטן ריאות תא קטן, ו אינדוקציה של המעבר אפיתל-to-mesenchal, אשר מתרחשים מראש קלינית קלינית. מנגנוני ההתנגדות ל-EGFR TKIs הם הטרוגנית. על-ידי זיהוי מנגנוני ההתנגדות החדשניים במחקרים קדם-קליניים, ייתכן שניתן יהיה לפתח therapeutics הרומן כדי להתגבר על התנגדות. טיפולים אופטימליים הרצף המקסם את התועלת הקלינית לחולים חייבים לשקול את מנגנוני ההתנגדות המטרה הטיפולית.
זה הכרחי לבחור את קו התא ההורה הנכון, כפי שהוא בסיס של כל הניסויים הבאים. אסטרטגיות הבחירה מתחילות ברלוונטיות קלינית; יש צורך לבחור כימותרפיה וקרינה קו התא נאיבי. הטיפול כימותרפיות הקודם ו/או רדיוטיבי עלול לגרום לשינוי של מסלולים התנגדות ושינויים של הביטוי של סמנים התנגדות התרופה. במחקר זה, PC-9 תאים, נשיאת 15 מחיקות bp ב-egfr אקסון 19, מועסקים להקמת התנגדות נרכש afatinib. קו תא זה נגזר מחולה NSCLC יפני, אשר לא קיבל כימותרפיה והקרנות קודמות.
מכיוון afatinib מנוהל דרך הפה על בסיס יומי, רציף טיפול מחוץ למים, שבו התאים הם מתורבתים כל הזמן בנוכחות afatinib יהיה רלוונטי קלינית. המינון של תרופות המשמשות בשלבים השונים של הניסוי חייב להיות ממוטב עבור קו התא הורים נבחר. ניתן להשתמש באפשרות לקביעת טווח תרופות מתאים, שאמור להיות דומה למידע הפרמקוקינטי של הסם.
בכל תהליך הבחירה, כל אוכלוסיית התאים נשמרת כקבוצה אחת; לא נעשה שימוש בשכפול או בשיטות הפרדה אחרות. התאים הראשונים נחשפים ברציפות לרמה נמוכה של הסם. לאחר מכן, לאחר שהתאים להסתגל לצמוח בנוכחות הסם, המינון של הסם עלה לאט למינון האופטימלי הסופי של התרופה10,11. לחילופין, ניתן להשתמש בטיפול בסמים או במוטגנזה לצורך בחירת תאי התנגדות, המבוצעים גם לפני טיפול תרופתי 12,13. למרבה הצער, מקרים בהם התנגדות לסמים אינה מצליחה להתפתח בדרך כלל לא מדווחת. אסטרטגיות הבחירה מפותחות במטרה לנסות לחקות את התנאים של חולי סרטן לבנייה מחדש של ההתנגדות הרלוונטית קלינית. לעיתים, כדי לזהות שינויים מולקולריים הקשורים במנגנונים של עמידות לסמים, נעשה שימוש בריכוז סמים גבוה. המודל הזה הופך להיות. פחות רלוונטי מבחינה קלינית
כאן, אנו מתארים שיטה להקמת שלושה קווי afatinib עצמאיים עמידים מפני PC -9 תאים מחסה 15 מחיקות bp ב-egfr אקסון 19, כמו גם את האפיון הראשוני של קווי התאים העמידים afatinib.
Protocol
Representative Results
Discussion
כאן, תיארנו שיטה להקמת שלושה קווים עצמאיים afatinib עמידים ומאופיין תאים אלה על ידי השוואה לתאי PC-9 הורים. על ידי חשיפה מינון הסלמה החורגת, ההורים PC-9 תאים רכשה עמידות afatinib לאורך תקופה של 10-12 חודשים. מבחינה קלינית, מנגנוני ההתנגדות של EGFR TKIs הם הטרוגנית, ולכן, לאחר הטיפול הראשוני עם afatinib, PC-9 תאים חו?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים לחבר במכון לחקר הסרטן המתקדם של מכון המחקר לקבלת הערות מתחשבות ועריכה עבור עזרתם בעריכת השפה האנגלית. עבודה זו נתמכת על ידי JSPS KAKENHI (מספר מענק: 16K09590 to T.Y.).
Materials
| afatinib | Selleck | S1011 | |
| anti-EGFR monoclonal antibody | cell signaling technology | 4267S | |
| bicinchoninc acid assay | sigma | B9643 | |
| cell-culture treated 10cm dish | Violamo | 2-8590-03 | |
| CELL BANKER1 | TakaRa | CB011 | cryopreservation media |
| CellTiter 96 | Promega | G4100 | Non-Radioactive Cell Proliferation Assay; Dye solution and Solubilization/Stop solution |
| DMSO | Wako | 043-07216 | |
| ECL solution | Perkin Elmer | NEL105001EA | |
| FBS | gibco | 26140-079 | |
| GeneAmp 5700 | Applied Biosystems | fluorescence-based RT-PCR-detection system | |
| GraphPad Prism v.7 software | GraphPad, Inc. | a statistical software | |
| NanoDrop Lite spectrophotometer | Thermo | spectrophotometer | |
| Nonfat dry milk | cell signaling technology | 9999S | |
| Pen Strep | gibco | 15140-163 | |
| phosphatase inhibitor cocktail 2 | sigma | P5726 | |
| phosphatase inhibitor cocktail 3 | sigma | P0044 | |
| Powerscan HT microplate reader | BioTek | ||
| Power SYBR Green master mix | Applied Biosystems | SYBR Green master mix | |
| protease inhibitor cocktail | sigma | P8340 | |
| QIAamp DNA Mini kit | Qiagen | 51306 | DNA purification kit |
| QIAquick PCR Purification Kit | QIAGEN | PCR purification kit | |
| RPMI-1640 | Wako | 189-02025 | with L-Glutamine and Phenol Red |
| TBST powder | sigma | T9039 | |
| Trans-Blot SD Semi-Dry Electrophoretic Transfer cell | Bio-Rad | semi-dry t4ransfer apparatus | |
| 96 well microplate | Thermo | 130188 |
References
- Chan, B. A., Hughes, B. G. Targeted therapy for non-small cell lung cancer: current standards and the promise of the future. Translational Lung Cancer Research. 4 (1), 36-54 (2015).
- Mitsudomi, T., Yatabe, Y. Mutations of the epidermal growth factor receptor gene and related genes as determinants of epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitors sensitivity in lung cancer. Cancer Science. 98 (12), 1817-1824 (2007).
- Yamaoka, T., Kusumoto, S., Ando, K., Ohba, M., Ohmori, T. Receptor tyrosine kinase-targeted cancer therapy. International Journal of Molecular Science. 19 (11), (2018).
- Marshall, J. Clinical implications of the mechanism of epidermal growth factor receptor inhibitors. Cancer. 107 (6), 1207-1218 (2006).
- Hirsh, V. Managing treatment-related adverse events associated with egfr tyrosine kinase inhibitors in advanced non-small-cell lung cancer. Current Oncology. 18 (3), 126-138 (2011).
- Arcila, M. E., et al. Rebiopsy of lung cancer patients with acquired resistance to EGFR inhibitors and enhanced detection of the T790M mutation using a locked nucleic acid-based assay. Clinical Cancer Research. 17 (5), 1169-1180 (2011).
- Sequist, L. V., et al. Genotypic and histological evolution of lung cancers acquiring resistance to EGFR inhibitors. Science Translational Medicine. 3 (75), 75ra26 (2011).
- Yang, J. C., et al. Osimertinib in pretreated T790M-positive advanced non-small-cell lung cancer: AURA study phase II extension component. Journal of Clinical Oncology. 35 (12), 1288-1296 (2017).
- Chong, C. R., Janne, P. A. The quest to overcome resistance to EGFR-targeted therapies in cancer. Nature Medicine. 19 (11), 1389-1400 (2013).
- Clynes, M., Redmond, A., Moran, E., Gilvarry, U. Multiple drug-resistance in variant of a human non-small cell lung carcinoma cell line, DLKP-A. Cytotechnology. 10 (1), 75-89 (1992).
- Yamaoka, T., et al. Distinct afatinib resistance mechanisms identified in lung adenocarcinoma harboring an EGFR mutation. Molecular Cancer Research. 15 (7), 915-928 (2017).
- Liang, X. J., Shen, D. W., Garfield, S., Gottesman, M. M. Mislocalization of membrane proteins associated with multidrug resistance in cisplatin-resistant cancer cell lines. Cancer Research. 63 (18), 5909-5916 (2003).
- Shen, D. W., Akiyama, S., Schoenlein, P., Pastan, I., Gottesman, M. M. Characterisation of high-level cisplatin-resistant cell lines established from a human hepatoma cell line and human KB adenocarcinoma cells: cross-resistance and protein changes. British Journal of Cancer. 71 (4), 676-683 (1995).
- Murakami, H., et al. Phase I study of continuous afatinib (BIBW 2992) in patients with advanced non-small cell lung cancer after prior chemotherapy/erlotinib/gefitinib (LUX-Lung 4). Cancer Chemotherapy and Pharmacology. 69 (4), 891-899 (2012).
- Nukaga, S., et al. Amplification of EGFR wild-type alleles in non-small cell lung cancer cells confers acquired resistance to mutation-selective EGFR tyrosine kinase inhibitors. Cancer Research. 77 (8), 2078-2089 (2017).
- Nakatani, K., et al. EGFR amplifications mediate resistance to rociletinib and osimertinib in acquired afatinib-resistant NSCLC harboring exon 19 deletion/T790M in EGFR. Molecualr Cancer Therapy. 18 (1), 112-126 (2019).
- Piotrowska, Z., et al. Heterogeneity underlies the emergence of EGFRT790 wild-type clones following treatment of T790M-positive cancers with a third-generation EGFR inhibitor. Cancer Discovery. 5 (7), 713-722 (2015).
- Ortiz-Cuaran, S., et al. Heterogeneous mechanisms of primary and acquired resistance to third-generation EGFR inhibitors. Clinical Cancer Research. 22 (19), 4837-4847 (2016).
- Kobayashi, Y., et al. Characterization of EGFR T790M, L792F, and C797S mutations as mechanisms of acquired resistance to afatinib in lung cancer. Molecular Cancer Therapy. 16 (2), 357-364 (2017).
- Uchibori, K., Inase, N., Nishio, M., Fujita, N., Katayama, R. Identification of mutation accumulation as resistance mechanism emerging in first-line osimertinib treatment. Journal of Thoracic Oncology. 13 (7), 915-925 (2018).
