Imágenes de alta resolución de la dinámica nuclear en células vivas bajo tensión de tracción uniaxial
Summary
Utilizando un dispositivo previamente diseñado para aplicar la cepa mecánica a las células adherentes, este papel describe una geometría de sustrato rediseñado y un aparato personalizado para la imagen de célula única de alta resolución de células tensas con un objetivo de inmersión de aceite 100x.
Abstract
Se sabe que la cepa mecánica extracelular provoca respuestas fenotísicas celulares y tiene relevancia fisiológica en varios sistemas tisulares. Para capturar el efecto de la tensión de tracción extracelular aplicada en las poblaciones celulares in vitro a través de Ensayos bioquímicos, un dispositivo ha sido previamente diseñado que puede ser fabricado simplemente y es lo suficientemente pequeño para caber dentro de incubadoras de cultivo de tejido, así como en la parte superior de etapas del microscopio. Sin embargo, el diseño anterior del sustrato de polidimetilsiloxano no permitía la creación de imágenes subcelulares de alta resolución a través de objetivos de inmersión en aceite. Este trabajo describe una geometría rediseñada del sustrato de polidimetilsiloxano y una configuración de imágenes personalizada que, en conjunto, puede facilitar la toma de imágenes subcelulares de alta resolución de las células vivas bajo tensión aplicada. Este sustrato se puede utilizar con el mismo dispositivo diseñado anteriormente y, por lo tanto, tiene las mismas ventajas que se enumeran anteriormente, además de permitir la imagen óptica de alta resolución. El diseño del sustrato de polidimetilsiloxano se puede mejorar mediante la incorporación de una rejilla que facilitará el seguimiento de la misma célula antes y después de la aplicación de la cepa. Los resultados representativos demuestran la creación de imágenes en tiempo de lapso de alta resolución de núcleos etiquetados con fluorescencia dentro de las células tensas capturadas utilizando el método descrito aquí. Estos datos de dinámicas nucleares proporcionan información sobre el mecanismo mediante el cual la cepa de tracción aplicada promueve la diferenciación de las células progenitoras de oligodendrocitos.
Introduction
Las células y los tejidos en el cuerpo están sometidos a diversas señales mecánicas, incluyendo las cepas de tracción. Sin embargo, los efectos de estas señales en la biología de las células neuronales aún no se han estudiado extensamente y entendido completamente. En el sistema nervioso central, las fuentes de la cepa mecánica incluyen crecimiento del desarrollo1,2,3,4, procesos fisiológicos tales como flexión de la médula espinal, sangre y líquido cefalorraquídeo palpitaciones y afecciones patológicas como trauma, hinchazón de Axon, cicatrices gliales o crecimiento tumoral5,6,7,8. Vale la pena investigar cómo la tensión de tracción afecta a la diferenciación de oligodendrocitos y la posterior mielinización de los axones, que es un proceso crítico en el sistema nervioso central del vertebrado. Utilizando un dispositivo de deformación de diseño personalizado y placas de multipozo elastoméricos, las obras anteriores9,10 han demostrado que la cepa uniaxial estática puede aumentar la diferenciación de oligodendrocitos a través de cambios globales en la expresión génica 10. para comprender mejor los mecanismos de la mecanotransducción de cepas en estas células, se debe rediseñar el anterior aparato experimental como se describe aquí, para permitir la imagen de fluorescencia de alta resolución de la dinámica nuclear en la vida células bajo tensión. Específicamente, se desarrolla una placa de polidimetilsiloxano de un solo pozo, y se rediseña la configuración de imágenes para permitir la toma de imágenes de lapso de tiempo de las células vivas bajo tensión utilizando una lente de inmersión de aceite 100x. Para eliminar los efectos ópticos negativos de polidimetilsiloxano en la vía de la luz, las células se muestran no a través de la placa de polidimetilsiloxano, pero en la posición invertida, a través del vidrio de la cubierta que cubre el compartimiento de la célula. Utilizando este nuevo diseño de imágenes, se registran cientos de películas de lapso de tiempo de alta resolución, de núcleos celulares individuales dentro de las células adherentes intactas, donde la cromatina se etiqueta etiquetando la histona H2B a la proteína fluorescente verde. Estas películas demuestran que la tensión de tracción induce cambios en la estructura de la cromatina y la dinámica que son consistentes con la progresión de la diferenciación de oligodendrocitos.
La toma de imágenes de células vivas bajo tensión aplicada es técnicamente desafiante y requiere un diseño de dispositivo compatible con el sistema del microscopio. El diseño personalizado descrito aquí presenta una alternativa barata a las soluciones comerciales. Sus dimensiones permiten su instalación en etapas de microscopio e imágenes de células vivas a alta resolución espacial durante la deformación aplicada. La configuración de imágenes está diseñada para facilitar la toma de imágenes de células vivas utilizando una lente de inmersión de aceite de 100x con la mayor claridad, a través del vidrio de la cubierta, no a través de la capa de placa de polidimetilsiloxano que de otra manera disminuye la calidad de imagen y es común en la mayoría configuraciones de imágenes bajo tensión. El dispositivo, con una placa montada que contiene las células, también se puede almacenar fácilmente en la incubadora. Este dispositivo está diseñado para aplicar la cepa uniaxial a substratos que facilitan el cultivo de células adherentes y mantienen una tensión estable y uniforme durante varios días. La configuración descrita aquí se puede utilizar para la imagen de alta resolución de varios tipos de células adherentes bajo tensión, por lo que es aplicable a los estudios de mecanotransducción en muchos campos de la mecanobiología celular.
Protocol
Representative Results
Discussion
Un dispositivo ha sido previamente1 diseñado para la aplicación de la tensión de tracción extracelular en las células adherentes. El diseño del sustrato de polidimetilsiloxano en ese trabajo fue suficiente para los ensayos bioquímicos, así como la imagen de baja resolución de las células estiradas. En este trabajo, se rediseñó el sustrato y se introdujo una nueva configuración de imágenes que facilita la imagen de células vivas subcelulares de alta resolución. Las ventajas de este …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Todos los autores reconocen con gratitud el apoyo a la financiación de la Fundación Nacional de investigación de Singapur a través del grupo de investigación interdisciplinar de la Alianza de Singapur-MIT para la investigación y la tecnología (SMART) BioSystems y Micromechanics (BioSyM). Los autores Dr. Jagielska y el Dr. van Vliet también reconocen con gratitud la financiación y el apoyo de la Fundación Saks-Kavanaugh. Los autores agradecen a William ONG y al Dr. Sing Yian Chew de la Universidad Tecnológica de Nanyang, Singapur, por proporcionar células progenitoras de oligodendrocitos de rata para algunos experimentos descritos en este trabajo, y los autores agradecen al Dr. g. v. Shivashankar de Instituto de mecanobiología, Universidad Nacional de Singapur, Singapur, para discusiones sobre las fluctuaciones de la zona nuclear.
Materials
| Primary cells | Primary Oligodendrocyte Progenitor Cells isolated from Neonatal Rats were provided by Dr. S. Y. Chew's lab at Nanyang Technological University |
||
| Media | |||
| DMEM high glucose | Gibco | 11996-065-500ml | |
| Pen/Strep | Gibco | 15070-063-100ml | |
| FGF | Prospec | CYT-608-50ug | |
| PDGF | Prospec | CYT-776-10ug | |
| Media Stock components | |||
| BSA | Sigma | A9418-10G | |
| Progesterone | Sigma | P8783-1G | |
| Putrescine | Sigma | P5780-5G | |
| Sodium Selenite | Sigma | S5261-10G | |
| Tri-iodothyronine | Sigma | T6397-100MG | |
| Thyroxine | Sigma | T1775-100MG | |
| Holo-Transferrin | Sigma | T0665-500MG | |
| Insulin | Sigma | I9278 | |
| Mold and PDMS plate | |||
| PDMS – Dow Corning Sylgard 184 | Ellsworth | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | |
| Mold – Liquid Plastic | Smooth-On | Smooth Cast 310 – Trail Size | |
| Substrate Coatings | |||
| poly-D-lysine | Sigma | P6407-5MG | |
| Fibronectin | Sigma | F1141-2MG | |
| Histone staining | |||
| CellLigt H2B-GFP BacMam | Molecular Probes | C10594 | |
| Surface functionalization | |||
| APTES | Sigma | A3648-100ml | |
| BS3 | Covachem | 13306-100mg | |
| HEPES buffer pH 8.0 | Alfa Aesar | J63578-AK-250ml | |
| Cell detachment | |||
| Accutase | Invitrogen | A1110501-100ml |
References
- Bray, D. Mechanical tension produced by nerve cells in tissue culture. Journal of Cell Science. 410, 391-410 (1979).
- Bray, D. Axonal growth in response to experimentally applied mechanical tension. Developmental Biology. 389, (1983).
- Van Essen, D. C. A tension-based theory of morphogenesis and compact wiring in the central nervous system. Nature. , (1997).
- Smith, D. H. Stretch growth of integrated axon tracts: Extremes and exploitations. Progress in Neurobiology. 89, 231-239 (2011).
- Cullen, D. K., Simon, C. M., LaPlaca, C. M. Strain rate-dependent induction of reactive astrogliosis and cell death in three-dimensional neuronal-astrocytic co-cultures. Brain Research. , 103-115 (2011).
- Fisher, E., et al. Imaging correlates of axonal swelling in chronic multiple sclerosis brains. Annals of Neurology. 2, 219-228 (2007).
- Nikić, I., et al. A reversible form of axon damage in experimental autoimmune encephalomyelitis and multiple sclerosis. Nature Medicine. 17, 495-500 (2011).
- Payne, S. C., Bartlett, C. A., Harvey, A. R., Dunlop, S. A., Fitzgerald, M. Functional loss during chronic secondary degeneration in rat optic nerve. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53, (2018).
- Zeiger, A. S., et al. Static mechanical strain induces capillary endothelial cell cycle re-entry and sprouting. Physical Biology. 13, 1-16 (2017).
- Jagielska, A., et al. Mechanical strain promotes oligodendrocyte differentiation by global changes of gene expression. Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 93 (2017).
- Pajerowski, J. D., Dahl, K. N., Zhong, F. L., Sammak, P. J., Discher, D. E. Physical plasticity of the nucleus in stem cell differentiation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 1, 0 (2007).
- Talwar, S., Kumar, A., Rao, M., Menon, G. I., Shivashankar, G. V. Correlated spatio-temporal fluctuations in chromatin compaction states characterize stem cells. Biophysical Journal. 104, 553-564 (2013).
- Makhija, E., et al. Mechanical strain alters cellular and nuclear dynamics at early stages of oligodendrocyte differentiation. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 59 (2018).
